楊旭東,張 杰,楊驕霞

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院,黑龍江牡丹江 157011;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院,黑龍江牡丹江 157011)

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,化學(xué)療法在胃癌治療中占有重要的地位,但其存在一定的不良反應(yīng)和耐藥性。隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷提高,中藥已經(jīng)成為當(dāng)今治療腫瘤的重要手段,其優(yōu)勢在于中藥不但對(duì)腫瘤具有抑制作用、不易產(chǎn)生耐藥性,而且對(duì)機(jī)體的損傷和副作用較小,因而中藥抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究已成為我國科學(xué)工作者的重要研究課題之一。白毛藤(Solamum lyratum Thunb)系茄科植物白英的全草,具有清熱利濕、消腫解毒之功效[1]。它作為抗癌中藥之一,已被證明水提物在體外有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性[2],但有關(guān)機(jī)制并不明確。本研究通過檢測重要的凋亡調(diào)控基因bcl-xl及抑癌基因 p53基因等指標(biāo),觀察了白毛藤對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞的影響,以期探討其作用機(jī)制,為其應(yīng)用于胃癌的臨床治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人胃癌BGC-823細(xì)胞株,由武漢中美科技有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

MTT試劑,泰倫生物科技有限公司產(chǎn)品,批號(hào)041025;Trizol,Sigma公司產(chǎn)品,批號(hào)15596-018;引物核苷酸片段,上海生工生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。550型酶標(biāo)儀,美國BIO-BAD公司產(chǎn)品;Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀(FCM),美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長,用 0.25%胰酶和0.02% EDTA 1∶1消化傳代。

1.4 分 組

白毛藤組:用RPMI 1640培養(yǎng)液倍比稀釋的2,4,8和16 g/L的白毛藤水提液。對(duì)照組:用含BGC-823細(xì)胞的RPMI 1640培養(yǎng)液。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 細(xì)胞增殖抑制率

采用MTT比色法測定。收集對(duì)數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,每孔 100μL接種于 96孔板中。每個(gè)劑量設(shè) 12個(gè)平行孔,分別培養(yǎng)12,24和48 h;再加入5 g/L MTT 20μL(調(diào)零組除外),繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸棄上清液,每孔加入150μL DMSO溶解樣品,采用酶標(biāo)儀測定各孔490 nm(OD)值。比色時(shí)以RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)零。按公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(inhibition rate,IR)。IR=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)× 100%。

1.5.2 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況

將培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,用70%乙醇4℃處理過夜;PBS洗滌1次,RNA酶(20mg/L)37℃消化30min;PBS洗滌1次,碘化丙啶(50mg/L、4℃)避光染色30min,取1×105細(xì)胞/mL,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況。

1.5.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

收集對(duì)數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1× 105個(gè)/mL,分設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,培養(yǎng) 72 h后,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5.4 Bcl-xl、P53表達(dá)

提取腫瘤細(xì)胞總RNA,用RT-PCR方法檢測腫瘤細(xì)胞bcl-xl、p53基因表達(dá)。bcl-xl上游引物為5′-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3′,下游引物為5′-GCGATCCGACTCACCAATAC-3′,擴(kuò)增片段448 bp。p53上游引物為5′-TTCTCTCCCCAACAATGAGG-3′,下游引物為5′-TCTGTGAAGCAGCACCATTC23′,擴(kuò)增片段531 bp。β-Action上游引物為5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′,下游引物為5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′,擴(kuò)增片段838 bp。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;變性30 s(94℃),退火30 s(58℃),延伸1min(72℃),共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7m in。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析,分別計(jì)算bcl-xl、p53與內(nèi)參擴(kuò)增帶熒光強(qiáng)度 ×面積的比值,得出bcl-xl、p53 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 白毛藤對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的影響

同一濃度白毛藤隨著作用時(shí)間延長對(duì)細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制作用明顯增強(qiáng)。隨著濃度增加,細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)。見表 1。由此表明,白毛藤抑制胃癌細(xì)胞的增殖,呈濃度和時(shí)間依賴性。

2.2 白毛藤對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞周期及凋亡率的影響

隨著濃度增加 G2/M期細(xì)胞的百分比逐漸增加,說明細(xì)胞阻滯在G2/M期。隨著濃度增加,細(xì)胞凋亡率逐漸增加,表明白毛藤具有明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。見表 2。

表1 各組胃癌BGC-823細(xì)胞生長抑制率對(duì)比 ±s

表1 各組胃癌BGC-823細(xì)胞生長抑制率對(duì)比 ±s

注:與白毛藤2 g/L組對(duì)比,*P＜0.05,**P＜0.01。

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表2 各組48 h后胃癌BGC-823細(xì)胞周期和凋亡率對(duì)比

2.3 白毛藤對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞形態(tài)的影響

與對(duì)照組對(duì)比,白毛藤各組胃癌細(xì)胞貼壁不牢,懸浮細(xì)胞增多,細(xì)胞體積變小,伴核固縮,胞質(zhì)內(nèi)黑色顆粒增多,培養(yǎng)基中可見大量細(xì)胞碎片,以16 g/L組處理48 h表現(xiàn)最為明顯。

2.4 白毛藤對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞bc1-xl和p53基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,不同濃度白毛藤作用 48 h后,腫瘤細(xì)胞中抑癌基因 p53基因表達(dá)逐漸增加、原癌基因bcl-xl基因表達(dá)逐漸降低,以16 g/L組最明顯。見表 3及圖 1～2。

表3 各組胃癌BGC-823細(xì)胞bc1-xl和p53表達(dá)情況對(duì)比 ±s

表3 各組胃癌BGC-823細(xì)胞bc1-xl和p53表達(dá)情況對(duì)比 ±s

注:與對(duì)照組對(duì)比,#P＜0.05,##P＜0.01。

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3 討 論

目前,治療腫瘤的多種化療藥物主要是通過影響腫瘤細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖目的的,但化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性較差,在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺死正常細(xì)胞,毒副作用大。因此,從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物,已成為抗腫瘤藥物研究的重要組成部分。白毛藤已被證實(shí)有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性。

細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡是一個(gè)緊密聯(lián)系、高度協(xié)調(diào)的過程,其在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡 ,是在精密調(diào)節(jié)下的細(xì)胞的主動(dòng)死亡過程,在個(gè)體生長發(fā)育過程中起重要作用。細(xì)胞凋亡的異常與多種病理生理過程相關(guān),如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫疾病等。bcl基因家族是重要的凋亡調(diào)控基因,包括抑凋亡基因bcl-2、bcl-xl和促凋亡基因bax、bak、bcl-xs等[3]。bcl-xl過表達(dá)與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系,能抑制化療等引起的凋亡,而下調(diào)其表達(dá)則能促進(jìn)凋亡發(fā)生[4]。p53基因?yàn)橐职┗?存在于正常細(xì)胞核中,對(duì)細(xì)胞損傷分化有抑制作用,具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[5]。p53編碼多功能的抑癌蛋白 p53,主要功能是在檢測基因組損傷、啟動(dòng)修復(fù)損傷基因組從而維持基因組穩(wěn)定,在抑制或阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)基因組損傷的細(xì)胞凋亡等方面起到?jīng)Q定性作用,從而抑制腫瘤的發(fā)生、去除衰老細(xì)胞等[6]。

本研究結(jié)果顯示:①白毛藤抑制胃癌細(xì)胞增殖,具有時(shí)效和量效關(guān)系,時(shí)間越長,濃度越大,抑制作用越明顯。②白毛藤可以明顯上調(diào)p53基因mRNA表達(dá),降低bcl-xl基因mRNA表達(dá)。③白毛藤使G2/M期細(xì)胞的百分比逐漸增加,凋亡細(xì)胞增加。根據(jù)以上結(jié)果,是否可以推斷白毛藤是因?yàn)樯险{(diào)p53基因mRNA表達(dá)、降低bcl-xl基因mRNA表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期而實(shí)現(xiàn)了抗胃癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡作用,此是否是其抗腫瘤機(jī)制之一,是否可以為白毛藤治療胃癌乃至所有腫瘤提供一個(gè)新的藥物作用靶點(diǎn),在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)是否具有上述作用等疑問,尚有待于進(jìn)一步證實(shí)。

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