單萍,康慧聰,劉志廣,李巷,朱遂強

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)科,武漢430030

研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞多藥抗藥性(multiple drug resistance,MDR)的形成與MDR1基因的過度表達有關(guān)。P-糖蛋白(P-glycoprotein,PGP)是MDR1基因表達的蛋白,通過能量依賴型的跨膜外排泵作用將進入細胞內(nèi)的藥物重新泵出細胞,減少藥物在細胞內(nèi)的蓄積,交叉抵抗若干結(jié)構(gòu)和功能并不相關(guān)的親脂類藥物。研究發(fā)現(xiàn)難治性癲癇患者腦組織中存在MDR1高表達現(xiàn)象,推測癲癇耐藥性可能與PGP高表達有一定關(guān)系。頻繁的癲癇發(fā)作或癲癇持續(xù)狀態(tài)可增加腦內(nèi)PGP、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance protein,MRP)等多藥耐藥轉(zhuǎn)運蛋白的表達,很可能因此減少抗癲癇藥物在腦內(nèi)的水平,與癲癇耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。本實驗觀察PGP在戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)致癲小鼠大腦皮質(zhì)的表達情況及PGP表達與癲癇發(fā)作時程的關(guān)系,進一步探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物：成年健康雄性C57BL/6小鼠64只,由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供,體質(zhì)量20～25 g。飼養(yǎng)于正常晝夜環(huán)境中,給予標準飼料及飲水。②主要試劑與材料：PTZ(購于 Sigma公司);Trizol、2 ×Taq PCR Master Mix(購于天根生化科技有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購于TOYOBO公司);瓊脂糖(西班牙進口分裝);三氯甲烷(購于天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠);異丙醇(購于國藥集團化學試劑有限公司);無水乙醇(購于上海振興化工廠);DEPC水(由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實驗室提供);Bio MarkerⅠ(購于BioFlux公司);引物設(shè)計及合成(由上海Invitrogen生物工程公司完成);Mdr1兔抗羊多克隆抗體、SABC-Cy3免疫組化試劑盒(生物素化抗兔IgG)(購于武漢博士德生物工程有限公司);異戊烷(購于天津市西青科隆試劑廠);多聚甲醛(購于天津市化學試劑研究所);冷凍切片包埋劑(OTC)(購于中杉金橋公司);甘油、TritonX-100(購于Amresco公司);PBS粉劑、牛血清白蛋白(購于武漢飛羿科技有限公司)。Ulrtospec3000型紫外分光光度儀(購于Pharmacia Biotech公司);PTC-1160型基因擴增儀(購于Bio-Rad公司);DYY-6B型電泳儀(購于北京市六一儀器廠);凝膠成像與分析系統(tǒng)(購于GeneGenius公司);CM1900型冰凍切片機(購于LEICA公司);臺式冷凍離心機(購于Gene公司);DP50-CU型熒光顯微鏡(購于OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及PTZ點燃模型的建立 64只小鼠隨機分為：對照組、1周組、2周組及1月組,各16只。對照組腹腔注射等量生理鹽水,其余各組小鼠均腹腔注射40 mg/(kg?d)PTZ,直至完全點燃(若連續(xù)14 d腹腔注射仍未點燃者予以剔除)。觀察小鼠行為,記錄小鼠癲癇發(fā)作情況,癲癇驚厥發(fā)作評分標準(按 smialowki癲癇發(fā)作分級標準)為：0級,無反應(yīng);1級,面部運動,指鼻子、點頭、奔跑;2級,前肢痙攣;3級,前肢痙攣伴后退;4級,前肢痙攣伴后退及摔倒發(fā)作;5級,摔倒、強直發(fā)作。點燃成功標準為：連續(xù)3 d PTZ腹腔注射后,小鼠均表現(xiàn)為4～5級發(fā)作[1]。對照組于腹腔注射后1周處死動物,其它各組分別于點燃1周、2周及1月處死動物,進行RT-PCR和免疫熒光組織化學實驗。

1.2.2 RT-PCR檢測各組小鼠大腦皮質(zhì)PGP mRNA表達 脊椎脫臼法處死小鼠,剜出鼠腦,置于冰上。迅速剝離雙側(cè)皮質(zhì),置于無RNA酶的Ep管中,保存于-80℃冰箱中,備用于RNA提取。稱取50 mg皮質(zhì)腦組織,剪碎,加Trizol試劑1 mL,于冰上預冷的玻璃勻漿器中反復研磨勻漿至澄清,室溫下放置5 min,4℃,12000 rpm離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新Ep管內(nèi),每管加氯仿200 μ L,蓋好管蓋,劇烈振蕩 15 s,室溫下放置3 min,4℃,12000 rpm離心15 min,小心吸取上清液500 μ L于無RNA酶的Ep管內(nèi),加500 μ L異丙醇,室溫下放置 20 min,以沉淀 RNA,于臺式冷凍離心機中 4℃,12000 rpm離心10 min,棄上清液,加入1 mL預冷的75%乙醇(DEPC處理過的水配制)洗滌RNA沉淀,于 4℃,5000 rpm離心3 min,棄上清液;空氣中干燥沉淀3 min,加入30 μ L無 RNA 酶水,反復吹打,混勻,充分溶解RNA。取1 μ L上述提取好的RNA溶解于99 μ L的無 RNA酶水中,紫外線分光光度儀上分別讀取在260 nm和280 nm波長處的光吸收值(A),測定RNA濃度,得到A260/A280比值,A260/A280比值位于1.8～2.0。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行,取2 μ g 細胞總 RNA,加入 Oligo(dT)20 1 μ L,無RNA酶水至12 μ L;65℃預變性5 min,置于冰上,總反應(yīng)體系20 μ L,30℃10 min,42℃20 min,99℃5 min,4℃5 min,瞬間離心,置-20℃冰箱保存。Mdr1上游引物：5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3',下游引物：5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3',產(chǎn)物 167 bp;β-actin 上游引物 ：5'-GGTATGGAATCCTGTCGCATCCATGAAA-3',下游引物 ：5'-GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3',產(chǎn)物 320 bp。PCR 反應(yīng) ：2 ×Taq PCR MasterMix 8 μ L,雙蒸水6 μ L,上下游引物各0.5 μ L,1 μ LcDNA作為模板,總反應(yīng)體積16 μ L。循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性8 min,94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸45 s,36個循環(huán),72℃后延伸8 min,4℃冰箱保存。反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,以同一標本的β-actin的產(chǎn)物積分光密度值校正各目的基因的積分光密度值,相對值=目的基因表達強度/β-actin表達強度。

1.2.3 免疫熒光組織化學檢測小鼠大腦皮質(zhì)PGP蛋白的表達 各組小鼠斷頭取腦,包被OTC膠后,立即放入-80℃預冷的異戊烷中,冷凍3 min,冰凍切片,片厚10 μ m。將冰凍切片放入4%多聚甲醛中4℃固定15 min,0.01 mol/L PBS(pH值7.2～7.4)搖床(60次/min)洗滌3次×5 min;封閉液封閉 2 h;加入 Mdr1兔抗羊多克隆抗體,4℃孵育過夜;PBS搖床洗滌3次×5 min;加入抗兔IgG,室溫孵育1 h;PBS搖床洗滌3次×5 min;加入SABC-Cy3,室溫避光孵育1 h;自來水沖洗45 min;50%甘油封片。以PBS代替一抗,同步進行上述免疫熒光組織化學染色,結(jié)果為陰性。光鏡下(400×)對各組免疫熒光陽性細胞進行細胞計數(shù)。每一腦片在皮質(zhì)隨機取6個視野,求其平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以(x-±s)表示,方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PTZ點燃動物模型的建立 腹腔注射PTZ數(shù)分鐘后,小鼠首先表現(xiàn)為面部運動,指鼻子、點頭、奔跑(1級)及前肢痙攣(2級);繼之出現(xiàn)前肢痙攣伴后退(3級);隨后出現(xiàn)前肢痙攣伴后退及摔倒發(fā)作(4級),強直發(fā)作(5級)等;發(fā)作時間持續(xù)數(shù)分鐘～數(shù)十分鐘。腹腔注射PTZ后共有4只動物出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)后死亡,6只動物未完全點燃,對照組未出現(xiàn)癲癇發(fā)作及行為異常。實際參與后續(xù)實驗的各組小鼠數(shù)目分別為對照組16只、1周組12只、2周組 12只,1月組 14只(各組動物一半用于RT-PCR實驗,一半用于免疫熒光組織化學實驗)。

2.2 PGP mRNA在各組小鼠大腦皮質(zhì)的表達 對照組皮質(zhì)內(nèi)可見少量PGP mRNA表達,腹腔注射PTZ后PGP mRNA表達隨時間延長而增加。對照組的PGP mRNA與內(nèi)參照光密度相對值為(0.68±0.05),1周組為(0.97±0.06),2周組為(1.25±0.09),PTZ注射1月組為(2.18±0.12),各組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見圖1A-B。

2.3 PGP蛋白在各組小鼠大腦皮質(zhì)的表達

對照組小鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)有少量細胞表達PGP,包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血管周圍內(nèi)皮細胞。神經(jīng)元陽性染色顯示胞體圓型,帶有一條長長的突起。膠質(zhì)細胞陽性表現(xiàn)胞體形狀多樣,可以為三角型、橢圓型、不規(guī)則型,細胞膜和細胞質(zhì)均可表現(xiàn)陽性染色。小鼠點燃后陽性細胞數(shù)隨時間延長而增加,對照組的陽性細胞數(shù)為(8.79±1.83)個,1周組為(14.83±1.45)個,2周組為(20.98±1.92)個,1月組為(39.84±2.07)個,各組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見圖2A-D。

3 討論

由于癲癇患者的生存時間比較長及倫理和方法學的原因,研究癲癇反復發(fā)作與PGP的關(guān)系,主要依賴于動物模型,選用理想的癲癇發(fā)作模型尤為重要。本實驗采用沒有神經(jīng)毒性的PTZ,通過反復腹腔給藥建立小鼠慢性點燃模型,制備簡單,成功率高,不受麻醉劑和手術(shù)過程的影響,不破壞局部腦組織,便于全面觀察動物的癲癇發(fā)作,能夠較為準確的反映癲癇發(fā)作和PGP表達的關(guān)系。

PGP屬于ATP結(jié)合蛋白超家族(ATP-binding cassette)[2],分布在細胞膜上,通過分解ATP發(fā)揮外排泵功能。PGP主要分布在和排泄有關(guān)的功能器官(如肝、腎和小腸),及和機體功能有關(guān)的部位(如血腦屏障、血睪丸屏障等)。在人體血腦屏障,PGP位于毛細血管近血管腔一側(cè),參與構(gòu)成血腦屏障,完善其功能[3]。PGP也表達在毛細血管外星形膠質(zhì)細胞足突上,在某種病理情況下如癲癇,腦內(nèi)內(nèi)環(huán)境改變引起血腦屏障完整性暫時破壞,此時PGP在星形膠質(zhì)細胞足突上表達增強,可能起到“第二道屏障”的作用[4],維持血腦屏障的功能,阻止有害物質(zhì)入侵。PGP的底物主要是高脂溶性物質(zhì),大多數(shù)抗癲癇藥物具有較強的脂溶性,以被動擴散方式進入腦組織[5],推測PGP可能限制抗癲癇藥物通過血腦屏障,參與難治性癲癇耐藥的發(fā)生。Rizzi等[6]通過海人酸誘導的發(fā)作模型,應(yīng)用微量透析技術(shù)測定腦內(nèi)海馬區(qū)細胞外苯妥英的濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Mdr1 mRNA水平最高的時間點,伴有透析液內(nèi)苯妥英濃度的升高。支持作為藥物外流轉(zhuǎn)運體PGP的過表達是難治性癲癇的重要耐藥機制。

在本實驗中,正常小鼠大腦皮質(zhì)腦組織中僅有少量PGP陽性表達,而慢性癲癇小鼠大腦皮質(zhì)腦組織中PGP表達上調(diào),隨點燃時間延長PGP表達增多,各組間具顯著性差異;慢性癲癇小鼠大腦皮質(zhì)腦組織 Mdr1 mRNA水平較正常小鼠高,隨時間延長,Mdr1 mRNA水平上升明顯,其中點燃后1周較正常小鼠升高約43%,2周較正常小鼠增加約83%,1月時增加約220%。筆者認為,生理情況下PGP在腦毛細血管內(nèi)皮細胞低表達,發(fā)揮解毒和維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能;病理情況下,PGP表達上調(diào),甚至在膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中亦有表達,這可能是患者對抗癲癇藥產(chǎn)生耐藥性的重要生物學基礎(chǔ)。

有關(guān)PGP表達與癲癇發(fā)作時程關(guān)系的研究較少。Kuteykin-Teplyakov等[7]對匹羅卡品誘導的癲癇持續(xù)狀態(tài)后的不同時間點腦內(nèi)各種多藥耐藥轉(zhuǎn)運基因(Mdr1a,Mdr1b,MRP1,MRP2,MRP5)隨時程變化的表達情況進行研究,結(jié)果顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)后的6～24 h Mdr1a,Mdr1b,MRP1和MRP5在海馬、杏仁核、皮質(zhì)的表達下調(diào),隨后各種多藥耐藥轉(zhuǎn)運基因的表達開始增加,2 d后達到高峰,隨后開始下降。認為早期的表達下調(diào)可能與癲癇持續(xù)狀態(tài)誘導的急性炎癥過程有關(guān),促炎性因子(如白介素-1、白介素-6、腫瘤壞死因子)可能有抑制PGP等多藥耐藥轉(zhuǎn)運體表達的作用。本研究顯示,慢性癲癇小鼠大腦皮質(zhì)腦組織中PGP表達隨癲癇反復發(fā)作時間延長而增多,與Kuteykin-Teplyakov等的研究有所不同。Kuteykin-Teplyakov等研究的是癲癇持續(xù)狀態(tài)后多藥耐藥轉(zhuǎn)運基因的表達,本研究是針對慢性癲癇。慢性癲癇病程中由于癲癇的反復發(fā)作導致PGP的表達隨病程延長而增多,推測癲癇反復發(fā)作是誘導PGP過量表達的重要因素之一,癲癇反復發(fā)作病程越長,對抗癲癇藥產(chǎn)生耐藥的可

能性就越大。

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