黃昕艷,王禹,張曉梅,趙錦程,朱曉峰

佳木斯大學神經(jīng)科學研究所,黑龍江佳木斯154007

研究表明,中藥遠志的主要有效成分遠志總皂苷(tenuigenin)在抗衰老、益智、抗氧化等方面有廣泛的生物活性,對阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的作用已被許多實驗所證實[1]。但對于AD的主要病理改變,即大量的神經(jīng)元及突觸的損傷與缺失[2],至今還缺乏明確有效的根治手段。神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)被公認為修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷的理想種子,但NSCs的臨床應用還存在著向功能神經(jīng)元定向分化及克服局部致傷環(huán)境等很多難題[3]。遠志總皂苷對NSCs分化的影響目前尚未見報道。本研究旨在探討遠志總皂苷在體外誘導NSCs分化中的作用,為AD的傳統(tǒng)中藥的治療探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物：新生SD大鼠(1～3 d),由佳木斯大學實驗動物中心提供。②主要試劑與材料：DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、兔抗大鼠單克隆神經(jīng)巢蛋白(Nestin)單克隆抗體、花青素 3(Cyanine 3,Cy3)標記的羊抗兔IgG、兔抗大鼠單克隆神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)單克隆抗體、B27、胎牛血清、SABC即用型試劑盒、DAB顯色試劑盒(購于Boster公司);堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長因子(epiderinal grow th factor,EGF)(購于 Invitrogen公司);遠志總皂苷(由佳木斯大學化學與藥學院提取),經(jīng)液相儀對比純度為75%,黃色粉末狀;遠志總皂苷母液配制：DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至1 mg/mL,4℃儲存。

1.2 方法

1.2.1 NSCs分離、培養(yǎng)及鑒定 取SD大鼠2只,75%乙醇體表消毒,移入超凈臺,斷頭,依次剪開頭皮、顱骨,去除大腦皮質(zhì),用眼科彎鑷于將海馬組織取出,剝?nèi)ッ黠@血管,于D-hank's液中漂洗數(shù)次后,移入預先加入完全培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)基+20 ng/mL bFGF+20 ng/mL EGF+2%B27)的小瓶中,用眼科剪剪成1 mm3小塊,吸管吹打成細胞勻漿,300目細胞篩網(wǎng)過濾成單細胞懸液,調(diào)整細胞密度為5×105/mL,移入50 cm2細胞培養(yǎng)瓶中,添加3～5 mL完全培養(yǎng)液,置于飽和濕度、37℃、5%CO2養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔3 d半量換液。Nestin免疫熒光染色鑒定：取懸浮培養(yǎng)第3代神經(jīng)球,接種于預先涂布0.1 g/L多聚賴氨酸的蓋玻片中,加完全培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,PBS洗去細胞表面培養(yǎng)液,0.1%Triton-PBS液中透膜15 min,室溫下5%山羊血清封閉30 min,加入一抗Nestin(1∶400稀釋),4℃孵育過夜;加入熒光二抗(1∶300稀釋),室溫避光孵育50 min;30%甘油封片,熒光倒置顯微鏡鏡檢。

1.2.2 分組及誘導NSCs分化 將培養(yǎng)的第3代神經(jīng)球離心,接種于預先置有蓋玻片的6孔板中制備細胞爬片,加標準培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)基+2%B27),待細胞達80%～90%融合基本鋪滿底壁時,吸去孔中培養(yǎng)液。隨機分為8組,1 d對照組(不給予遠志總皂苷誘導,培養(yǎng)1 d),小劑量遠志總皂苷1 d組(給予5 μ g/mL遠志總皂苷誘導培養(yǎng)1 d),中劑量遠志總皂苷 1 d組(給予20 μ g/mL遠志總皂苷誘導培養(yǎng)1 d),大劑量遠志總皂苷1 d組(給予100 μ g/mL遠志總皂苷誘導培養(yǎng)1 d),3 d對照組(不給予遠志總皂苷誘導,培養(yǎng)3 d),小劑量遠志總皂苷3 d組(給予5 μ g/mL遠志總皂苷誘導培養(yǎng)3 d),中劑量遠志總皂苷 3 d組(給予20 μ g/mL遠志總皂苷誘導培養(yǎng)3 d),大劑量遠志總皂苷3 d組(給予100 μ g/mL遠志總皂苷誘導培養(yǎng)3 d);誘導培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)基+2%B27+不同濃度的遠志總皂苷;每組6孔。將培養(yǎng)板置飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔2 d半量置換培養(yǎng)液。光學倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)球及細胞形態(tài)。

1.2.3 NSE免疫細胞化學染色 對誘導培養(yǎng)后的各組細胞進行 NSE免疫細胞染色：PBS洗去細胞表面培養(yǎng)液,0.1%Triton-PBS液中透膜15 min,10%BSA-PBS封閉2 h;加入一抗NSE(1∶200稀釋),4℃孵育過夜;加入羊抗兔二抗(1：200稀釋)室溫避光孵育50 min;滴加SABC復合物,37℃濕盒孵育30 min,加新鮮配制的DAB溶液顯色,待顯色充分后,加入三蒸水終止反應,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡觀察。每組6張培養(yǎng)NSCs的蓋玻片,每張蓋玻片上隨機選6個視野,計數(shù)細胞總數(shù)、NSE陽性細胞數(shù)及陽性細胞百分率。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以(x-±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCs的原代、傳代培養(yǎng)及鑒定 原代培養(yǎng)2～5 d后,即可獲得大量呈懸浮生長、大小不一的神經(jīng)球,見圖1A。原代的神經(jīng)球經(jīng)機械分離進行傳代培養(yǎng)可形成新的神經(jīng)球,經(jīng)Nestin免疫熒光染色呈陽性,提示為NSCs,見圖1B。

2.2 遠志總皂苷干預下NSCs形態(tài)變化遠志總皂苷誘導傳至3代的NSCs球,貼壁后2 h即可見細胞球周圍有多個細小突起,隨時間延長,突起逐漸密集、延伸,與對照組相比,細胞球周邊的突起較長,較密集;細胞于24 h后出現(xiàn)形態(tài)變化,細胞多呈三角形,見圖1C;于第3天出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化,細胞逐漸伸出突起,向四周伸展,變長、變細,與鄰近分化細胞交織成網(wǎng)狀。

2.3 NSE陽性細胞率比較 取各組誘導分化細胞固定,NSE免疫細胞化學染色結(jié)果顯示,遠志總皂苷干預各組NSE陽性細胞率較對照組顯著增加(P＜0.01),NSE表達量增加,見圖 2A-D、表1。

3 討論

NSCs是來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多能干細胞,具有自我更新能力和多項分化潛能,可能直接或間接替代受損的神經(jīng)細胞和組織,為AD的治療開辟新的思路。但目前 NSCs應用于臨床仍有許多問題需要解決。研究表明,無論是NSCs移植后或是原位誘導分化,大多數(shù)NSCs分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞,向神經(jīng)元分化的比例較小,所得到的功能神經(jīng)元的數(shù)量遠不能滿足治療的需求[4,5],如何提高NSCs向功能神經(jīng)元分化,成為NSCs替代治療的關鍵。

許多中藥具有健腦、抗氧化、抗衰老和調(diào)節(jié)免疫功能的功效。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就有關于遠志的記載,謂“益智慧,耳聰目明,不忘,倍力,久服輕身不老”等功效。馬正立等[6]發(fā)現(xiàn),遠志等有抑制乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AchE)活性,增加腦內(nèi)Ach含量的作用,有改善記憶和學習功能,即益智作用。陳勤等[7]給大鼠遠志皂苷連續(xù)灌胃60 d后,發(fā)現(xiàn)其能顯著升高大鼠腦內(nèi)的M受體密度,增加乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性,明顯提高擬癡呆模型鼠的學習記憶能力。中藥遠志在退行性疾病中有廣泛的應用前景,但遠志對NSCs分化的影響尚未見報道。

表1 遠志總皂苷對NSCs分化為神經(jīng)元的影響(%,x-±s)

皂苷,根據(jù)前期實驗結(jié)果設立3個不同濃度5 μ g/mL,20 μ g/mL 及 100 μ g/mL,作用于傳至3代的NSCs球,誘導分化時間為1 d、3 d,對各實驗組進行 NSE免疫細胞染色。結(jié)果顯示低、中、高濃度遠志總皂苷組干預1 d、3 d均可提高NSE陽性細胞率,以中劑量(20 μ g/mL)組NSE陽性細胞率最高。

本研究還觀察到,經(jīng)遠志總皂苷誘導2 h后即可見神經(jīng)球周圍有多個細小突起,與常規(guī)血清誘導分化相比,遠志總皂苷可能使NSCs開始分化的時間提前;誘導24 h后,可見細胞球周邊有分化出的神經(jīng)元樣細胞。誘導3 d,神經(jīng)球周邊神經(jīng)元樣的分化細胞增多,相鄰細胞球之間形成神經(jīng)網(wǎng)絡連接。筆者初步推測在NSCs分化早期,遠志總皂苷可能促使其神經(jīng)纖維生成、生長,并在神經(jīng)纖維相互之間的連接起到一定作用,使NSCs球之間、神經(jīng)細胞之間聯(lián)系密切。遠志總皂苷可能參與了NSCs向神經(jīng)元的分化。

本研究顯示,遠志總皂苷在一定程度上能促進體外培養(yǎng)的NSCs分化為神經(jīng)元,NSCs移植與原位誘導可能可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,但遠志總皂苷干預后NSCs分化細胞的種類、功能及其在體內(nèi)促NSCs分化作用仍需進一步研究。

[1] 姜勇,屠鵬飛.遠志研究進展[J].中草藥,2001,32(8)：759-761.

[2] Goedert M,Spillantini MG.A century of Alzheimer's disease[J].Science,2006,314(5800)：777-781.

[3] Amar AP,Zlokovic BV,Apuzzo MLJ.Endovascular restorative neurosurgery：A novel concept for molecular therapy of the nervous system[J].Neurosurgery,2003,52(2)：402-413.

[4] Chizhikov VV,Millen KJ.Roof plate-dependent patterning of the vertebrate dorsal central nervous system[J].Dev Biol,2005,277(2)：287-295.

[5] Chao J,Chao L.Experimental therapy with tissue kallikrein agains cerebral ischemia[J].Front Biosci,2006,11：1323-1327.

[6] 馬正立,汪麗亞.調(diào)心、補腎中藥對大鼠腦基底核損傷所致乙酰膽堿酯酶變化的影響[J].老年學雜志,1993,13(5)：301-303.

[7] 陳勤,曹炎貴,張傳惠.遠志皂苷對β-淀粉樣肽和鵝膏蕈氨酸引起膽堿能系統(tǒng)功能降低的影響[J].藥學學報,2002,37(12)：913-917.