渠文生,方軍,楊琴,詹燕,李在望,王偉#,田代實(shí)#

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)科,武漢430030;2.襄樊市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北襄樊441021;3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇無錫214023

多發(fā)性硬化、老年性癡呆、脊髓損傷和腦血管病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程均伴有炎癥反應(yīng)[1-3]。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)主要的炎癥相關(guān)細(xì)胞,在各種損傷刺激下,可以快速反應(yīng),如活化、遷移、吞噬、抗原提呈及大量因子釋放等[4]。過度的炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷的重要原因之一,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化有利于損傷修復(fù)[5]。本研究觀察表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的特異性單克隆抗體西妥昔(Cetuximab)對原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和遷移的影響,探討西妥昔在神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動(dòng)物：新生Wistar大鼠(＜3 d),由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。②主要試劑與材料：胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、高糖 DMEM/F12培養(yǎng)基(購于 Hyclone公司);25 cm2塑料培養(yǎng)瓶、12孔及24孔塑料培養(yǎng)板(購于Corning公司);胰蛋白酶、多聚賴氨酸、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、Triton(購于碧云天生物技術(shù)研究所);細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(購于 Sigma-aldrich公司);西妥昔(購于Merck公司);小鼠抗大鼠CD11b單克隆抗體(購于Biosciences公司);兔抗小鼠磷酸化EGFR單克隆抗體(購于Cell signal公司);異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、花青素3(Cyanine 3,Cy3)標(biāo)記的羊抗兔IgG(購于 Jackson ImmunoResearch公司);Transwell小室(8 μ m 孔,12孔板裝載)(購于Corning公司);激光共聚焦熒光顯微鏡、倒置顯微鏡(購于Olympus公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(購于Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及純化 取4只新生大鼠,無菌條件下剪開脊髓背部皮膚,撥開脊柱棘突,游離胸腰段脊髓,取出后放入冰PBS液中反復(fù)沖洗以去除血污。剝離脊膜取出脊髓組織,剪成小塊,轉(zhuǎn)入含有0.125%胰酶的3 mL PBS液中,37℃消化10 min。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基3 mL,吸管反復(fù)吹打至組織碎解。4℃1000 rpm離心5 min,棄上清液,加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基4 mL重懸細(xì)胞后種植于培養(yǎng)瓶中。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后換用含20%胎牛血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基,不換液培養(yǎng) 10 d。在37℃恒溫?fù)u床上200 rpm搖動(dòng)2 h后,收集上清液。4℃1000 rpm離心5 min收集細(xì)胞,即得到純化的小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察及EGFR表達(dá)檢測 將純化的小膠質(zhì)細(xì)胞均勻種植于24孔培養(yǎng)板內(nèi)經(jīng)多聚賴氨酸包被的載玻片上(約1×105/孔),用含10%胎牛血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d。隨機(jī)分為LPS干預(yù)組(給予終濃度為1 μ g/mL LPS),西妥昔處理組(在 LPS干預(yù)前 30 min給予終濃度為20 nM西妥昔)[6,7]和對照組(在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予等量PBS)。免疫熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)。LPS干預(yù)后3 h,細(xì)胞爬片經(jīng)PBS輕洗2次,100%甲醇室溫固定15 min,0.2%Triton-PBS液中透膜15 min,10%BSA-PBS封閉2 h;加入一抗CD11b(1∶50稀釋)及磷酸化EGFR(1∶100稀釋),4℃孵育過夜;加入熒光二抗(1∶200稀釋)室溫避光孵育50 min;DAPI染核5 min;30%甘油封片,共聚焦顯微鏡下照相。

1.2.3 遷移實(shí)驗(yàn) 用含10%胎牛血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基調(diào)整純化的小膠質(zhì)細(xì)胞濃度至1×106/mL,取100 μ L細(xì)胞懸液加到Transwell上室。將小室放入含 500 μ L相同培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板中。小室隨機(jī)分為6組：西妥昔孵育組(上、下室均給予終濃度為20 nM西妥昔),LPS誘導(dǎo)組(上室給予終濃度為 1 μ g/mL LPS),西妥昔+LPS 誘導(dǎo)組(LPS干預(yù)前30 min在上下室均加入終濃度為20 nM西妥昔),LPS趨化組(下室給予終濃度為 1 μ g/mL LPS),西妥昔 +LPS趨化組(LPS干預(yù)前30 min在上下室均加入終濃度為20 nM西妥昔)和對照組(在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予等量的PBS)。將 Transwell小室放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h后,棄去培養(yǎng)基,100%甲醇室溫固定細(xì)胞20 min;用棉簽蘸去濾膜上層未遷移的細(xì)胞,PBS輕洗至上層無細(xì)胞;將小室放入考馬斯亮藍(lán)染液中室溫染色10 min;PBS輕洗至液體清亮。由對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不了解的第三方用倒置顯微鏡(200×目鏡)拍照后計(jì)數(shù)。每次隨機(jī)選取4個(gè)視野,取平均值作為1個(gè)樣本。設(shè)對照組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)為100%,其余各組遷移細(xì)胞數(shù)分別除以對照組,得到各組細(xì)胞相對遷移率。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(x-±s)表示,組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 純化后的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光標(biāo)記鑒定,可見明顯的綠色熒光定位于胞膜,符合CD11b膜抗原分布特點(diǎn)。經(jīng)DAPI復(fù)染細(xì)胞核可確定小膠質(zhì)細(xì)胞的純度＞97%。正常培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)蝌蚪樣,細(xì)胞體積小,突起較少,CD11b染色適中,見圖1A1。LPS誘導(dǎo)3 h時(shí),可觀察到明顯的細(xì)胞形態(tài)變化,表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大,突起增多,CD11b染色明顯增強(qiáng);在胞膜褶皺的基礎(chǔ)上,有大量的針尖樣突起形成,見圖1B1。與對照組相比,西妥昔處理組的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化不甚明顯;與LPS干預(yù)組相比,西妥昔處理組的小膠質(zhì)細(xì)胞體積減小,突起少,CD11b染色淺,見圖1C1。

2.2 磷酸化EGFR的表達(dá)情況 通過免疫熒光雙標(biāo)發(fā)現(xiàn),磷酸化EGFR在正常培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞呈低表達(dá),主要分布于胞膜,胞漿有部分著色,見圖1A2。LPS干預(yù)3 h后,磷酸化EGFR的表達(dá)明顯增高,尤其是在小膠質(zhì)細(xì)胞胞膜顯色強(qiáng),見圖1B2;西妥昔處理組磷酸化EGFR的表達(dá)水平明顯低于 LPS干預(yù)組,接近于對照組見圖1C2。

2.3 細(xì)胞遷移情況 鏡下觀察發(fā)現(xiàn),約30%的小膠質(zhì)細(xì)胞在6 h內(nèi)遷移至下室?？捡R斯亮藍(lán)染色使細(xì)胞整體呈鮮亮的藍(lán)色,見圖2A-C;肉眼可見,LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞密度明顯多于對照組,見圖2A-B;西妥昔+LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞密度較LPS誘導(dǎo)組顯著減少,見圖2B-C。設(shè)對照組細(xì)胞遷移率為100%,各組相對細(xì)胞遷移率分別為：西妥昔孵育組(99.6±19.6)%,LPS誘導(dǎo)組(165.8±13.8)%,西妥昔+LPS誘導(dǎo)組(119.4±7.4)%,LPS趨化組(112.0±16.8)%,西妥昔+LPS趨化組(105.3±8.8)%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞遷移率顯著高于對照組(P＜0.01),西妥昔+LPS誘導(dǎo)組顯著低于LPS誘導(dǎo)組(P＜0.01);LPS趨化組和西妥昔+LPS趨化組之間細(xì)胞遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩組與對照組相比,細(xì)胞遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)上呈現(xiàn)活化特征,增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力;EGFR的特異性抑制抗體西妥昔可有效緩解LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化,降低其遷移能力。

炎癥是機(jī)體對感染、損傷和創(chuàng)傷等的一種正常反應(yīng)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),這種反應(yīng)可以由原位細(xì)胞介導(dǎo),也可以通過浸潤的外周免疫細(xì)胞發(fā)揮?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞是主要的炎癥介導(dǎo)細(xì)胞。一般認(rèn)為,其來源可以是被病理因素活化的原位定植小膠質(zhì)細(xì)胞,或外周浸潤的來源于脊髓的單核巨噬細(xì)胞。復(fù)雜的免疫反應(yīng)被啟動(dòng)后,可中和異常抗原、修復(fù)損傷組織和促進(jìn)創(chuàng)傷愈合,最終恢復(fù)組織內(nèi)環(huán)境的平衡[4]。但過度的炎癥反應(yīng)可引起繼發(fā)性損傷[5]。小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)多種細(xì)胞表面受體,產(chǎn)生多種釋放因子,如前炎癥因子、抗炎因子、一氧化氮、反應(yīng)性活性氧類物質(zhì)和谷氨酸等。炎癥因子的釋放,氧化應(yīng)激的加劇,興奮性毒性的產(chǎn)生,以及后續(xù)膠質(zhì)疤痕的形成,使神經(jīng)元存活和軸突修復(fù)微環(huán)境進(jìn)一步受累,引起繼發(fā)性損傷[8]?；诖死碚?抑制損傷后過度的炎癥反應(yīng),成為神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病治療的新思路。

LPS是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分。較高濃度的LPS與單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞膜受體結(jié)合,啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),引起多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的合成和釋放,如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6和一氧化氮等,引起廣泛而強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)[7]。LPS通常被作為小膠質(zhì)細(xì)胞的活化刺激因子。和文獻(xiàn)報(bào)道相符,本研究觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS刺激下的活化改變。LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)阿米巴狀,突起增多,表面膜褶皺增多。這一形態(tài)學(xué)的變化,被認(rèn)為與其功能的發(fā)揮相適應(yīng),并伴隨遷移能力的增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)LPS可以導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),但是并沒有觀察到LPS對小膠質(zhì)細(xì)胞具有明顯的趨化作用。有研究通過鏡下觀察發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS刺激的前2 h出現(xiàn)偽足增多和遷移現(xiàn)象,隨后遷移現(xiàn)象不再明顯。此現(xiàn)象出現(xiàn)的機(jī)制目前尚不清楚,可能與LPS誘導(dǎo)的多種細(xì)胞內(nèi)骨架組分的改變有關(guān)[9]。

西妥昔是EGFR的特異性單克隆抗體,目前已經(jīng)被作為癌癥治療藥物應(yīng)用于臨床。在非腫瘤組織內(nèi),EGFR通路在以內(nèi)皮細(xì)胞為代表的多種細(xì)胞中均有表達(dá),并與細(xì)胞增殖、分化及分泌等多種活動(dòng)相關(guān)[10]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),EGFR可表達(dá)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。對星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究表明,EGFR抑制劑可顯著減輕EGF引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[11]。此結(jié)論提示,EGFR通路可能在小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮同樣的作用,參與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和遷移等細(xì)胞活動(dòng)。

本研究表明,LPS誘導(dǎo)EGFR的磷酸化增加,即EGFR通路的活化。EGFR的特異性抑制抗體西妥昔明顯減輕小膠質(zhì)細(xì)胞活化后的EGFR磷酸化,同時(shí)緩解LPS引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。此結(jié)果表明,EGFR參與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化過程,西妥昔可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。但EGFR并非 LPS的受體,此過程的具體機(jī)制尚不清楚。文獻(xiàn)提示,LPS主要通過激活MAPK通路使小膠質(zhì)細(xì)胞活化,而MAPK通路是EGFR的主要下游通路之一[8,10]。筆者推測,西妥昔可能通過抑制LPS引起的MAPK通路激活影響小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)。

此外,西妥昔顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。有報(bào)道表明,EGF可以增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的趨化能力,并對小膠質(zhì)細(xì)胞有趨化性[12]。提示EGFR通路在小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移過程中起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),西妥昔雖不能減弱正常培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力,但是對于LPS活化的小膠質(zhì)細(xì)胞卻有明顯作用。這可能與活化小膠質(zhì)細(xì)胞伴隨的EGFR通路的活化有關(guān)。EGFR通路在小膠質(zhì)細(xì)胞遷移過程中的分子機(jī)制尚無文獻(xiàn)依據(jù),推測可能與多種通路的激活和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的功能性改變相關(guān)[9,10]。

本研究在原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞上研究了LPS對小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和遷移的影響,EGFR通路的激活與小膠質(zhì)細(xì)胞活化特性之間的關(guān)系,以及西妥昔對小膠質(zhì)細(xì)胞活化和遷移的調(diào)控作用。EGFR有望成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的新靶點(diǎn);西妥昔可能通過調(diào)控?fù)p傷后炎癥,從而在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中發(fā)揮積極的作用。

[1] Meinl E,Krumbholz M,Derfuss T,et al.Compartmentalization of inflammation in the CNS：a major mechanism driving progressive multiple sclerosis[J].J Neurol Sci,2008,274(1-2)：42-44.

[2] Schlachetzki JC,Hüll M.Microglial activation in Alzheimer's disease[J].Curr Alzheimer Res,2009,6(6)：554-563.

[3] Tian DS,Xie MJ,Yu ZY,et al.Cell cycle inhibition attenuates microglia induced inflammatory response and alleviates neuronal cell death after spinal cord injury in rats[J].Brain Res,2007,1135(1)：177-185.

[4] Innamorato NG,Lastres-Becker I,Cuadrado A.Cuadrado,role of microglial redox balance in modulation ofneuroinflammation[J].Curr Opin Neurol,2009,22(3)：308-314.

[5] Stoll G,Jander S,Schroeter M.Detrimental and beneficial effects of injury-induced inflammation and cytokine expression in the nervous system[J].Adv Exp Med Biol,2002,513：87-113.

[6] Luwor RB,Lu Y,Li X,et al.The antiepidermal grow th factor receptor monoclonal antibody cetuximab/C225 reduces hypoxiainducible factor-1 alpha,leading to transcriptional inhibition of vascular endothelial growth factor expression[J].Oncogene,2005,24(27)：4433-4441.

[7] Horvath RJ,Nutile-McMenemy N,Alkaitis MS,et al.Differential migration,LPS-induced cytokine,chemokine,and NO expression in immortalized BV-2 and HAPI cell lines and primary microglial cultures[J].J Neurochem,2008,107(2)：557-569.

[8] Harry GJ,Kraft AD.Neuroinflammation and microglia：considerations and approaches for neurotoxicity assessment[J].Expert Opin Drug Metab Toxicol,2008,4(10)：1265-1277.

[9] abd-el-Basset E,Fedoroff S.Effect of bacterial wall lipopolysaccharide(LPS)on morphology,motility,and cytoskeletal organization of microglia in cultures[J].J Neurosci Res,1995,41(2)：222-237.

[10]Hackel PO,Zwick E,Prenzel N,et al.Epidermal growth factor receptors：critical mediators of multiple receptor pathways[J].Curr Opin Cell Biol,1999,11(2)：184-189.[11]Liu B,Chen H,Johns TG,et al.Epidermal growth factor receptor activation：an upstream signal for transition of quiescent astrocytes into reactive astrocytes after neural injury[J].J Neurosci,2006,26(28)：7532-7540.

[12]Nolte C,Kirchhoff F,Kettenmann H.Epidermal growth factor is a motility factor for microglial cells in vitro：evidence for EGF receptor expression[J].Eur J Neurosci,1997,9(8)：1690-1698.