姚曉艷,李紅戈

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院,武漢430022

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)以往被認(rèn)為主要由胎肝及成人腎臟產(chǎn)生,作用僅限于調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成。近期研究發(fā)現(xiàn),EPO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)亦有表達(dá),并受氧供的調(diào)控[1]。EPO可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)[2,3],提示其可能是一種新的促血管生成因子,參與血管新生。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)激活產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞源性一氧化氮是重要的血管重塑因子[4]。eNOS是否參與 EPO調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生過程目前尚不十分清楚。本研究以內(nèi)皮細(xì)胞株為研究對象,觀察重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin,rH-EPO)對缺血缺氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生作用,及該作用與VEGF和eNOS間關(guān)系,以探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細(xì)胞株：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(EA.hy926),由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共實驗平臺細(xì)胞庫提供。②主要試劑與材料：高糖DMEM培養(yǎng)基(購于Gibco公司);胎牛血清(購于杭州四季青公司);無糖Earle's液、rH-EPO(購于沈陽三生公司);5 mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、8 μ m 孔徑 Transwell聚碳酸酯膜(購于Corning公司);去生長因子Matrigel(購于BD公司);人VEGF酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(購于深圳達(dá)科為公司);Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購于Invitrogen公司);實時(Real-time)PCR試劑盒(購于TOYOBO公司);兔抗人eNOS多克隆抗體(購于Santa Cruz公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(購于武漢博士德公司);引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長,每2天換液1次,待細(xì)胞融合約80%時傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于以下實驗。

1.2.2 實驗分組與氧糖剝奪-復(fù)氧復(fù)糖(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型構(gòu)建 OGD前將無糖Earle's液置于缺氧培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2與95%N2混合氣)中過夜飽和,分為：①正常對照組,正常條件培養(yǎng);②OGD組,將細(xì)胞用無糖Earle's液完全換液,置缺氧培養(yǎng)箱恒定孵育4 h,取出復(fù)氧復(fù)糖同時換為不含rH-EPO的無血清培養(yǎng)基,正常條件繼續(xù)孵育;③1 U/mL rH-EPO組,OGD條件同OGD組,取出復(fù)氧復(fù)糖同時換為含1 U/mL rH-EPO的無血清培養(yǎng)基,正常條件繼續(xù)孵育;④5 U/mL rH-EPO組,OGD條件同OGD組,取出復(fù)氧復(fù)糖同時換為含5 U/mL rH-EPO的無血清培養(yǎng)基,正常條件繼續(xù)孵育。

1.2.3 MTT還原實驗測細(xì)胞增殖率[5]加設(shè)空白組(不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基)用以調(diào)零。各組設(shè) 6個復(fù)孔,按方法 1.2.2孵育24 h后 ,每孔加入 20 μ L MTT,孵育 4 h;再向每孔加200 μ L DMSO,震蕩使紫色結(jié)晶溶解,測570 nm波長下吸光度(OD)值。增殖率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(正常對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.4 細(xì)胞體外遷移實驗 預(yù)先用1 g/L明膠包被 Transwell小室膜下表面,室溫過夜。按方法1.2.2,OGD 4 h后復(fù)氧復(fù)糖時直接消化細(xì)胞,各組用含相應(yīng)濃度 rH-EPO的無血清培養(yǎng)基制成1×105/mL單細(xì)胞懸液。每組設(shè)3個復(fù)孔,將 Transwell置于配套24孔板內(nèi),向下室加600 μ L無血清培養(yǎng)基,上室加100 μ L單細(xì)胞懸液,置正常培養(yǎng)箱孵育24 h后,用棉簽輕輕去除多聚酯膜的上室面細(xì)胞,4%多聚甲醛固定后行結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下觀察,每膜選取 0、3、6、9點鐘及正中心共5個視野,計數(shù)膜的下表面細(xì)胞數(shù)并拍照。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞體外小管形成實驗 各組設(shè)6個復(fù)孔,4℃預(yù)冷96孔培養(yǎng)板,冰上操作,每孔加50 μ L Matrigel膠,置 37 ℃培養(yǎng)箱 1 h使之凝固。同1.2.4方法制作單細(xì)胞懸液,每孔接種3×104個細(xì)胞,置正常培養(yǎng)箱孵育18 h。倒置顯微鏡下,每孔選取0、3、6、9點鐘及正中心共5個視野,觀察小管數(shù)目及管狀結(jié)構(gòu)完整性并拍照。

1.2.6 ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中VEGF含量 各組設(shè)3個復(fù)孔,按方法1.2.2孵育48 h,按試劑盒說明書操作,在測量波長450 nm、參考波長570 nm條件下讀取吸光度,據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品VEGF濃度。

1.2.7 實時PCR分析eNOS mRNA表達(dá)水平變化 各組設(shè) 3個平行樣本,按方法1.2.2孵育 24 h,用 Trizol提取總 RNA 1 μ g,按Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μ L。內(nèi)參β-actin正義引物序列：5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-'3,反義引物序列5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-'3,擴(kuò)增長度 190 bp;eNOS正義引物序列 5'-ATGTCCTCAAAGCCATCCAG-'3,反義引物序列5'-TCACTTCGTACGTTCGCAGG-'3,擴(kuò)增長度144 bp;將引物用無菌三蒸水稀釋至2.5 pmol/μ L。嚴(yán)格按照 TOYOBO 實時PCR反應(yīng)試劑盒說明書操作,總反應(yīng)體系25 μ L,退火溫度58℃。分析擴(kuò)增曲線結(jié)果,結(jié)果以各組與正常對照組相對比值表示。

1.2.8 Wester blot法分析eNOS蛋白表達(dá)水平變化 各組設(shè) 3個平行樣本,按方法1.2.2孵育48 h,棄培養(yǎng)基,加預(yù)冷RIPA細(xì)胞裂解液100 μ L,冰浴30 min,12000 g,4 ℃離心30 min后取上清。BCA法定量蛋白濃度。加等量的2×SDS上樣緩沖液,95℃變性5 min。每孔加 50 μ g 細(xì)胞總蛋白,經(jīng)125 g/L SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜;室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜2 h;加入兔抗人eNOS(1∶1000)一抗,4℃過夜;洗膜后與相應(yīng)二抗室溫孵育1 h;漂洗后ECL發(fā)光,常規(guī)顯影。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析其灰度值,結(jié)果以目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 上述實驗均重復(fù)3次。用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以(x-±s)表示,多樣本組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rH-EPO促EA.hy926細(xì)胞增殖作用

MTT結(jié)果顯示,OGD組細(xì)胞增殖率比正常對照組顯著下降(P＜0.05);1 U/mL rHEPO和5 U/mL rH-EPO組細(xì)胞增殖率均較OGD組提高(P＜0.05),且5 U/mL rHEPO組高于1 U/mL rH-EPO組(P＜0.05),見表 1。

2.2 rH-EPO促EA.hy926細(xì)胞遷移效應(yīng)

Transwell小室細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示,OGD組細(xì)胞遷移數(shù)少于正常對照組(P＜0.05);1 U/mL rH-EPO組和5 U/mL rHEPO組細(xì)胞遷移數(shù)均高于OGD組(P＜0.05),見表 1、圖 1A-D 。

2.3 rH-EPO促EA.hy926細(xì)胞的管樣結(jié)構(gòu)形成效應(yīng) Matrigel小管形成實驗結(jié)果顯示,OGD 4 h可致小管形成數(shù)目較正常對照組減少(P＜0.05),且管腔結(jié)構(gòu)的完整性差。1 U/mL rH-EPO組和5 U/mL rH-EPO組平均小管數(shù)均高于OGD組(P＜0.05),見表1、圖2A-D。

2.4 rH-EPO對細(xì)胞分泌VEGF的影響ELISA結(jié)果顯示,OGD組培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量較正常對照組減少(P＜0.05);1 U/mL rH-EPO組和5 U/mL rHEPO組VEGF分泌量均高于OGD組(P＜0.05),且5 U/mL rH-EPO組高于1 U/mL rH-EPO組(P＜0.05),見表1。

2.5 rH-EPO對eNOS mRNA及蛋白表達(dá)的影響 OGD組eNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平低于正常對照組(P＜0.05),1 U/mL rH-EPO組和5 U/mL rH-EPO組高于OGD組(P＜0.05),見圖3A-B。

3 討論

EPO及其受體(erythropoietin receptor,EPOR)在神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá),構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的EPO旁分泌和自分泌系統(tǒng)[1],其表達(dá)受組織氧供調(diào)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞來源于同一間質(zhì)祖細(xì)胞,但內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的EPOR是否具有或具有怎樣的生物學(xué)效應(yīng),是否只是2種細(xì)胞之間普通進(jìn)化關(guān)系的一個遺跡反映,值得深入研究。Rabatti等[6]研究顯示,rH-EPO可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs的血管新生。EA.hy926是 HUVECs與人肺腺癌細(xì)胞株A549的融合株,具有內(nèi)皮細(xì)胞特性,廣泛用于內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究,體外實驗已證實EA.hy926細(xì)胞亦表達(dá) EPOR[7]。因此,本研究選擇以 EA.hy926為研究對象,利用體外OGD誘導(dǎo)細(xì)胞缺血缺氧損傷模型,并用外源性rH-EPO進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示,與OGD組相比,rH-EPO干預(yù)可顯著促進(jìn)受損內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生作用,包括細(xì)胞增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

表1 rH-EPO對EA.hy926細(xì)胞增殖、遷移、小管形成及分泌VEGF的影響(x-±s)

與OGD組相比,rH-EPO干預(yù)可提高培養(yǎng)上清液中VEGF含量,提示rH-EPO可能通過激活VEGF/VEGFR系統(tǒng),間接影響內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血管新生[8]。VEGF又可上調(diào)EPO表達(dá),促進(jìn)骨髓造血,具有循環(huán)激活趨勢。具體機(jī)制有待于研究。

已有動物實驗研究顯示,eNOS參與調(diào)節(jié)局灶性腦缺血后的血管新生過程[9]。本實驗在此基礎(chǔ)之上提出如下假設(shè)：促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)保護(hù)性eNOS水平,是EPO促血管新生作用的機(jī)制之一。利用聚合酶鏈反應(yīng)及免疫印記法檢測rH-EPO干預(yù)對eNOS基因及其蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示,與正常培養(yǎng)的EA.hy926相比,OGD可降低eNOS基因及其蛋白表達(dá)水平,而復(fù)氧復(fù)糖的同時行rH-EPO干預(yù)則可逆轉(zhuǎn)這一變化。這與Livius等[10]的的研究結(jié)論相一致。

最近也有研究發(fā)現(xiàn),EPO可通過上調(diào)eNOS表達(dá)來減輕缺血所致肌皮組織損傷,但對VEGF表達(dá)并無影響[11],與本研究結(jié)果不完全一致;究其原因可能與組織來源及實驗?zāi)Ｐ筒煌嘘P(guān),值得我們進(jìn)一步研究。此外,rH-EPO與VEGF及eNOS相互間的確切關(guān)系和調(diào)節(jié)機(jī)制尚未十分明了,這都將成為本課題組下一步深入研究方向。

總之,rh-EPO可促進(jìn)缺血后EA.hy926細(xì)胞的體外血管新生作用,且該作用機(jī)制可能與rH-EPO促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF,并上調(diào)eNOS基因表達(dá)、增加eNOS蛋白含量有關(guān)。EPO的促血管新生作用或許可成為治療缺血性腦腦血管病的新靶點。

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