鄭立紅，陳 萍，梅慶步，劉 楓，吳 楠

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

趨化因子在卵巢癌組織中的表達(dá)及其意義

鄭立紅，陳 萍，梅慶步，劉 楓，吳 楠

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

目的：探討卵巢癌組織中趨化因子（RANTES）蛋白與mRNA的表達(dá)水平及臨床意義。方法：采用免疫組化法和原位雜交技術(shù)檢測(cè)卵巢癌組織中RANTES蛋白和mRNA表達(dá)，分析其與卵巢癌生物學(xué)特征之間的關(guān)系。結(jié)果：RANTES蛋白在卵巢癌及轉(zhuǎn)移灶中的陽(yáng)性率明顯高于卵巢良性腫瘤，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。RANTES mRNA在卵巢癌及卵巢良性腫瘤中的陽(yáng)性率分別為75.55%和11.76%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RANTES蛋白與mRNA表達(dá)與癌的組織學(xué)分級(jí)及TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：RANTES蛋白在卵巢癌中有陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)水平與卵巢癌侵襲發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

卵巢癌；RANTES；原位雜交；免疫組織化學(xué)

卵巢癌（ovarian carcinoma，OC）是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤。在腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化及定向遷移過(guò)程中，趨化因子發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。趨化因子是一種能夠結(jié)合到靶細(xì)胞上特異性G蛋白偶聯(lián)受體的化學(xué)誘導(dǎo)因子，其參與調(diào)節(jié)生理性和病理性白細(xì)胞遷移。其中受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子 （regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）是乳腺癌、卵巢癌以及宮頸癌等腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的主要趨化因子[1-2]。本文采用免疫組化和原位雜交技術(shù)對(duì)卵巢癌及良性腫瘤組織、卵巢良性疾病組織中RANTES的蛋白和mRNA表達(dá)進(jìn)行研究，以探討RANTES在卵巢癌中的表達(dá)情況及其與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

收集齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2000～2008年卵巢癌組織及卵巢癌盆腔腹膜轉(zhuǎn)移灶實(shí)施根治手術(shù)標(biāo)本45例，上皮性良性腫瘤組17例，卵巢良性疾病組織20例。術(shù)前均未接受化療，患者平均年齡54歲（35～72歲），臨床資料完整，石蠟標(biāo)本保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化檢測(cè)RANTES蛋白每例標(biāo)本切取4 μm厚切片，試劑RANTES為鼠單克隆抗體，免疫組化試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司，具體按常規(guī)SP法操作。免疫組化染色性反應(yīng)應(yīng)為黃至棕黃色顆粒，RANTES定位細(xì)胞漿，以細(xì)胞數(shù)＞10%為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性強(qiáng)度分級(jí)：細(xì)胞數(shù)10%～25%為（+），25%～50%為（++），＞50%為（+++）。

原位雜交法檢測(cè)RANTES mRNA，按原位雜交法的要求對(duì)RANTES陽(yáng)性的病例標(biāo)本進(jìn)行固定和石蠟包埋，切片至4～6 μm。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，過(guò)氧化物酶和胃蛋白酶處理后，加入預(yù)雜交液，40℃濕盒內(nèi)預(yù)雜交3 h，吸除預(yù)雜交液，加含有探針雜交液，42℃濕盒內(nèi)過(guò)夜，加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過(guò)氧化物酶37℃濕盒內(nèi)各15 min，DAB顯色，中性樹膠封片。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（不含探針）和陰性對(duì)照組（預(yù)先用RNA酶消化40 min）。陽(yáng)性雜交結(jié)果可見胞漿著色呈棕紫藍(lán)色顆粒。按照陽(yáng)性細(xì)胞比例≤10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分；按染色強(qiáng)弱：陰性為0分；淡黃（藍(lán)）色染色為1分；中度黃（藍(lán)）色染色為2分，棕黃（紫藍(lán)）色染色為3分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理所有數(shù)據(jù)，χ2檢驗(yàn)比較率的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RANTES蛋白在不同卵巢組織中的表達(dá)

卵巢癌組織中RANTES蛋白的陽(yáng)性表達(dá)位于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈彌漫棕黃色顆粒，它們?cè)诹馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)同非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在正常卵巢組織中多呈陰性表達(dá)（表1）。

2.2 RANTES mRNA在不同卵巢組織中的表達(dá)

卵巢癌組織中RANTES mRNA的陽(yáng)性表達(dá)位于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈彌漫棕黃色顆粒，在正常卵巢組織中呈陰性表達(dá)；它們?cè)诹馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)同非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.3 卵巢癌中RANTES的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

在≥60歲和＜60歲卵巢癌患者中RANTES蛋白和mR NA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。不同臨床分期的RANTES蛋白和mRNA的表達(dá)不同，晚期卵巢癌中RANTES蛋白和mRNA陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高。Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 卵巢癌中RANTES蛋白及mRNA陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Tab.1 The relationship between RANTES protein and mRNA positive expression and clinical pathological characteristic[n(%)]

3 討論

已證明很多因素參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，但不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞遷移到特定部位的分子機(jī)制還不清楚。趨化因子是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的小分子，具有調(diào)節(jié)各種類型的白細(xì)胞遷移、吸引具有特定趨化因子受體的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到炎癥部位參與炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)。在腫瘤細(xì)胞定向遷移的過(guò)程中，趨化因子通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)的受體相互作用，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞骨架重排，促使腫瘤細(xì)胞緊密黏附于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)定向性遷移[3-4]。RANTES是一種由68個(gè)氨基酸組成的小蛋白，屬于快速增長(zhǎng)CC類趨化因子家族，是趨化T細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞的CC類趨化性細(xì)胞因子，也是一種腫瘤細(xì)胞表達(dá)的主要趨化性細(xì)胞因子，并與卵巢癌、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病進(jìn)展有關(guān)[5]。在腫瘤部位，RANTES通過(guò)募集并活化單個(gè)核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致MMP表達(dá)，RANTES促進(jìn)血管生長(zhǎng)可能與增加MMP9表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生有關(guān)。RANTES在乳腺癌、宮頸癌中可作為預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)[6]。卵巢癌患者血清中RANTES的異常升高與腫瘤的分期有關(guān)，隨著惡性程度的增加，血清RANTES含量增高[7]。Zhou等[8]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞也同樣表達(dá)RANTES。本研究通過(guò)免疫組化方法，檢測(cè)到卵巢癌中有RANTES蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率為80%，而在正常卵巢組織中無(wú)表達(dá)或表達(dá)較弱。研究發(fā)現(xiàn)，很多趨化因子可能參與了生理性、病理性淋巴管的形成和調(diào)節(jié)，并參與了腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)、歸巢和轉(zhuǎn)移的控制[9]。淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)分泌趨化因子趨化腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移[10]。本研究表明，在卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中RANTES也有強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)（85.71%），并且RANTES在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中的表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。同時(shí)，在分析RANTES表達(dá)與臨床病理的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，RANTES的表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、TNM分期密切相關(guān)，而患病年齡無(wú)顯著差異。進(jìn)一步通過(guò)原位雜交的方法檢測(cè)卵巢癌中RANTES mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示原位雜交與免疫組化結(jié)果基本一致，這一結(jié)果進(jìn)一步支持了免疫組化的檢測(cè)結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，RANTES在卵巢癌組織的高表達(dá)與卵巢癌的發(fā)展、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示RANTES的表達(dá)在卵巢癌侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，RANTES有可能成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。

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Expression and their biological significances of RANTES proteins and mRNA in human ovarian carcinoma

ZHENG Lihong,CHEN Ping,MEI Qingbu,LIU Feng,WU Nan
(Qiqihar Medical College,Heilongjiang Province,Qiqihar 161006,China)

[Absrtact]Objective:To study the expression of regulated on activation,normal T cell expressed and secreted(RANTES) protein and mRNA in human ovarian carcinoma(OC),evaluate the relationship between the expression of RANTES protein and the clinic pathology factors,and lymph node metastasis of OC and to analyze the clinical significance.Methods:Expression of RANTES was examined by immunohistochemistry in benign ovarian tumors and malignant ovarian carcinoma. The expression of RANTES and mRNA in these specimens were detected by in-situ hybridization.The relationship between expression and biologic characteristic of ovarian carcinoma was analyzed.Results:The positive expression of RANTES protein in ovarian carcinoma was higher than that in benign ovarian tumors,there was a significant statistic difference between two groups(P＜0.05).The expression rate of RANTES protein was closely correlated with the histological grade, lymphatic metastasis and TNM grade in ovarian carcinoma(P＜0.05).The expression rates of RANTES mRNA in ovarian carcinoma and benign ovarian tumors were 75.55%,11.76%respectively,there was a significant statistic difference between two groups(P＜0.05).The expression rate of RANTES mRNA was closely correlated with the histological grade and TNM grade in ovarian carcinoma(P＜0.05).Conclusion:Higher expression of RANTES may be related to development,invasion and metastasis of ovarian carcinoma.

Ovarian carcinoma;RANTES;In-situ hybridization;Immunohistochemistry

R737.31

A

1673-7210（2011）02（c）-024-02

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱：卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移趨化因子作用的研究；項(xiàng)目編號(hào)：11541414）。

2010-12-16）