余 瓊，張 巍，杜 陽，楊旭升

(1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080；2.黑龍江省科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001）

東北林蛙及東北林蛙油是食、療兼用的佳品，東北林蛙具有養(yǎng)肺滋腎，治虛勞咳嗽之功效，東北林蛙油具有“健脾胃、滋陰補(bǔ)腎、補(bǔ)虛退熱，潤肺生津，利水消腫”之功能，主治體虛氣弱，氣血虧損，脾胃虛弱，產(chǎn)后諸虛，肺瘩咳血，精力耗損，記憶減退，神經(jīng)性頭痛，眩暈、失眠，神經(jīng)衰弱[1～5]。亦用于病后失調(diào)，產(chǎn)后無乳以及盜汗、水腫腹脹，瘡疾，瘡?fù)茨[毒等癥。

東北林蛙及東北林蛙油均可食用，其味美肉嫩，“肉味如雞”，可烹制多種菜肴、湯菜，并可與人參、鹿茸等補(bǔ)品一起烹制。此外，尚可用其油做制豆?jié){、油糖，軟糖等別具地方風(fēng)味的高級(jí)補(bǔ)品。

東北林蛙油以油塊肥厚、色黃白不帶皮卵、無碎渣、白露到霜降產(chǎn)的最好。一等:黃白色，光亮，大厚片，不帶皮、卵，無碎渣而新干者。二等:黃白色，光亮，片大整齊，不帶皮、卵，有碎塊但不超過20%之新干者。三等:黃色或黃褐色，烏暗無光，碎塊較多，無皮、卵，不變質(zhì)而干燥者?；斓龋焊韶?，呈不規(guī)則的腦髓似的塊狀，黃白色光亮，間有黑紅色。片大，味腥[6～9]。

近些年來，隨著社會(huì)的發(fā)展，人民生活水平的提高，東北林蛙油逐步進(jìn)入了公眾的日常生活。在東北各地，尤其是在黑龍江，許多林蛙養(yǎng)殖場已經(jīng)建立，相應(yīng)的林蛙制品廠也已經(jīng)形成規(guī)模，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷海外[10～15]。但是從總體而言，我國的林蛙產(chǎn)業(yè)還處于低端。林蛙制品也多由傳統(tǒng)工藝制備而成[16～18]。相應(yīng)的林蛙保健食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度雖然很快，但并未形成規(guī)模。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

林蛙為3月份采集，3月齡，購于伊春市五馬河區(qū)林蛙養(yǎng)殖場。

昆明種小鼠，雄性，5周齡，體重200g～229g，自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 林蛙油的提取

1.取材。從東北林蛙上取下東北林蛙的輸卵管，使用生理鹽水清洗。2.勻漿。使用組織勻漿機(jī)，將取下的輸卵管勻漿。3.鹽析。在洗脫液中加入固體硫酸銨,至比重達(dá)到1.24,置4℃冰箱過夜。取出后過濾,收集濾液。4.萃取。向?yàn)V液中加入乙酸乙酯，充分混合，靜置2～3h。5.收集。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，收集所提取的油相有機(jī)物，后將油相有機(jī)物融于10%的乙醇液中。

1.2.2 衰老模型的制備

小鼠每日頸背部皮下注射5%D-半乳糖生理鹽水溶液0.5mL/只，連續(xù)6周。給藥器械需經(jīng)高壓蒸汽滅菌，每只鼠注射前需用75%酒精搽拭注射針頭。普通飼料常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠的分配

實(shí)驗(yàn)小鼠共分為3組，共45只，各15只。一組為對(duì)照組，使用傳統(tǒng)方法提取的東北林蛙油灌胃，每日一次；另一組為實(shí)驗(yàn)組，使用改良方法提取的東北林蛙油，灌胃，每日一次；第三組為空白對(duì)照組，使用的小鼠為D-半乳糖所致衰老小鼠。

1.2.4 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 負(fù)重游泳時(shí)間的測(cè)定

于末次給藥后24h，在小鼠尾根部系一重為2g的砝碼，將小鼠輕輕放于游泳池水面上(游泳池為一內(nèi)壁光滑的圓形塑料桶，桶內(nèi)水深20cm，水溫恒定于18℃，水面距桶口10cm)，用秒表記錄小鼠自放在水面至沉入水底且不再掙扎的時(shí)間，此時(shí)間即為負(fù)重游泳時(shí)間。

1.2.4.2 耐常壓缺氧時(shí)間的測(cè)定

于末次給藥后30min將小鼠單只放入裝有10g鈉石灰的150mL無色透明的廣口瓶內(nèi)，用周圍涂了凡士林的瓶蓋迅速密封廣口瓶，用秒表記錄自瓶口密封至小鼠呼吸停止的時(shí)間，此時(shí)間即為耐常壓缺氧時(shí)間。

1.2.4.3 碳粒廓清實(shí)驗(yàn)

制備墨汁稀釋液:將墨汁搖勻后用NS稀釋(NS與墨汁的體積比為5:1)，將稀釋液置于超聲波清洗器內(nèi)超聲混勻2min。

末次給藥后30min，小鼠尾靜脈注射墨汁稀釋液10mL/kg體重，于注射后1min（t1）及5min(t2)而從眼眶靜脈叢各取血40mL，溶于4mL l%(w)Na2C03溶液中，在光徑1cm、波長680nm處以Na2C03溶液空白管調(diào)零測(cè)定吸光度A1及AZ，并取小鼠肝、脾稱其濕重。

1.2.4.4 學(xué)習(xí)及記憶能力的測(cè)定

分別于皮下注射5%D-半乳糖生理鹽水溶液前、注射3周及6周時(shí)測(cè)定學(xué)習(xí)及記憶能力。

跳臺(tái)法：給藥后30min，將小鼠放在跳臺(tái)箱內(nèi)未通電的箱底銅柵上適應(yīng)3min，然后對(duì)箱底的銅柵通電5min。小鼠受到電擊，其正常反應(yīng)是跳上陶瓷圓柱體平臺(tái)以躲避傷害性刺激。若小鼠跳回到箱底銅柵上，即為錯(cuò)誤。以5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績。24h后重做該實(shí)驗(yàn)，將通電時(shí)間改為3min，以小鼠第一次由陶瓷圓柱體平臺(tái)跳回到箱底銅柵上所需的時(shí)間 (即潛伏期)及3min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)作為記憶成績。

2 結(jié)果與分析

2.1 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 對(duì)常壓耐氧時(shí)間級(jí)附中游泳時(shí)間的影響

由表1可見，相對(duì)于空白對(duì)照組，傳統(tǒng)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在常壓耐氧時(shí)間和負(fù)重游泳時(shí)間上都有很大的提高。但相對(duì)傳統(tǒng)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組在此兩項(xiàng)數(shù)據(jù)上的提高程度更大些。

表1 Table 1

2.2.2 對(duì)碳粒廓清能力的影響

如表2所示，使用改進(jìn)方法和傳統(tǒng)工藝制備的東北林蛙油均能使D-半乳糖所致衰老模型小鼠己降低的碳粒廓清能力顯著升高。但兩種之間的差異并不顯著。

表2 Table 2

2.2.3 跳臺(tái)法

如表3所示：在6周后，兩種林蛙油制品均可提高小鼠的學(xué)習(xí)能力。但相對(duì)而言，采用新工藝提取的林蛙油的效果更好些。

表3 Table 3

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過采用部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證東北林蛙提取脂肪酸的抗衰老作用。通過本實(shí)驗(yàn)，可以明知東北林蛙提取物在某些方面的保健作用強(qiáng)于采用傳統(tǒng)工藝制備的東北林蛙油。但本實(shí)驗(yàn)所取得的數(shù)據(jù)，與吳慶平,吳英俊等所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定差距?？赡苁且?yàn)閷?shí)驗(yàn)所取原料的差異所致。

在進(jìn)行本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)之前，筆者根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)林蛙加工者仍采用所謂的傳統(tǒng)工藝制備林蛙油?？梢姳緦?shí)驗(yàn)提出新方法有很大的應(yīng)用空間。但新方法耗費(fèi)大，仍有許多需要改進(jìn)的地方才能適用于工業(yè)生產(chǎn)。

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