張 喆,李 健,王 蕓,3,韓俊英,4

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,山東 青島 266071;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510300;3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 200090;4.大連海洋大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧 大連 116023)

細(xì)胞色素P450酶系(cytochrome P450 monooxygenases,簡(jiǎn)稱 CYP)是廣泛存在于幾乎所有生物體中的一類代謝酶[1],是一簇結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似而又有差異,由基因超家族編碼的含血紅素和硫羥基的結(jié)合蛋白,可以代謝多種內(nèi)源物質(zhì)(保幼激素及其類似物、蛻皮甾酮、脂肪酸和信息素等)和外源物質(zhì)(藥物、環(huán)境毒物等),與生物的生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)密切相關(guān),具有重要的生物學(xué)意義[2]。雖然海洋無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞色素P450酶的含量較之哺乳動(dòng)物要低很多[3],但其在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中所起的作用卻受到人們極大的關(guān)注。

CYP4家族是細(xì)胞色素P450酶系中最古老的家族之一,大約起源于12.5億年以前[4],目前在人類、大鼠、魚(yú)及多種節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn),其功能涉及脂肪酸的 ω-羥化反應(yīng)及保幼激素的降解等多種內(nèi)源性物質(zhì)的代謝,同時(shí)也參與多種外源化合物的代謝。有關(guān)無(wú)脊椎動(dòng)物編碼 CYP4蛋白相關(guān)基因的研究在昆蟲(chóng)中取得了較好進(jìn)展,中國(guó)學(xué)者先后由致倦庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性株及淡色庫(kù)蚊抗溴氰菊酯品系內(nèi)克隆得到的細(xì)胞色素P450,經(jīng)比對(duì)均屬于CYP4家族[5,6],說(shuō)明CYP4家族可能與動(dòng)物體內(nèi)溴氰菊酯代謝有關(guān)。目前有關(guān)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞色素P450的研究主要集中在基因克隆及功能分析方面。CYP4基因在許多海洋甲殼動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn),包括青蟹(Carcinus maenas)[7]、利莫斯螯蝦(Orconectes limosus)[8]、湖蝦(Penaeus setiferus)和美洲螯龍蝦(Homarus americanus)等,并研究了CYP4基因?qū)Ρ讲④拧⒍嗦嚷?lián)苯、多環(huán)芳烴等環(huán)境污染物的響應(yīng)[9]。中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)主要分布于中國(guó)黃渤海和朝鮮西部沿海,是中國(guó)主要的養(yǎng)殖蝦類,而有關(guān)中國(guó)對(duì)蝦細(xì)胞色素P450基因的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。

作者根據(jù)本室克隆得到的中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建CYP4基因表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)該基因在大腸桿菌(Escherichia coli)中的原核表達(dá),并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。為今后制備免疫抗體,建立免疫組化方法對(duì)中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用中國(guó)對(duì)蝦購(gòu)自山東省青島市膠州寶榮水產(chǎn)公司,于實(shí)驗(yàn)條件下暫養(yǎng)10 d至RNA提取。

1.2 質(zhì)粒與菌株

原核表達(dá)載體 pET28a由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖生物疾病控制與病原分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng);克隆菌株 DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;表達(dá)菌株Rosetta(DE3)購(gòu)自上海今邁生物科技有限公司。

1.3 試劑及工具酶

Ex-Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自 TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶 NheI、XhoI和低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購(gòu)自NEB公司;膠回收純化試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;卡那霉素、IPTG、丙烯酰胺等均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.4 中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因的RT-PCR擴(kuò)增

1.4.1 引物合成與設(shè)計(jì)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室得到的中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因cDNA序列(GenBank登陸號(hào)：GU218693.1)的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì),利用Primer Primer 5 軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物：上游引物 CYP4 - F：5’-GCGCTAGCTGGATTTACAAAAGACAGCAAAAGGTGTG-3’; 下 游 引 物CYP4-R：5’-GCCTCGAGTTATTTCCTGGGATGAAGCTTTAGGGGA-3’,由上海生工生物工程有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增片段 1446bp,其中在上游和下游引物5’端各引入NheI和XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)和保護(hù)堿基。

1.4.2 目的片段的擴(kuò)增與回收

采集健康中國(guó)對(duì)蝦肝胰腺提取總 RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：滅菌雙蒸水 17.25 μL,10×buffer(含 Mg2+) 2.5 μ L,dNTP(10 mmol/L) 2 μL,CYP4-F (10 mmol/L) 1μL,CYP4-R (10 mmol/L) 1 μL,cDNA 模板 1 μL,DNA 聚合酶0.25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,65℃退火2 min,72 ℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分離,回收目的條帶,方法參照瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行。

1.5 重組質(zhì)粒p28a-CYP4的構(gòu)建與鑒定

將回收的PCR產(chǎn)物與pET28a用Xho I 和Nhe I進(jìn)行雙酶切,在T4連接酶作用下將CYP4基因與線性 pET28a載體連接,構(gòu)建表達(dá)載體 p28a-CYP4,轉(zhuǎn)化 HD5α后利用 Kan抗性平板篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR、雙酶切及測(cè)序(上海生工生物工程有限公司)鑒定,以確定開(kāi)放閱讀框編碼正確。DH5α的轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.6 CYP4基因在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒p28a-CYP4轉(zhuǎn)化Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4,pET28a轉(zhuǎn)化 Rosetta菌株構(gòu)建重組菌株 Rosetta/pET28a,挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于 LB液體培養(yǎng)基(含Kan 30 μg/mL 和 Cam 34 μg/mL)中 37℃培養(yǎng)至 OD600約為0.4～0.6時(shí),加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)6 h,取菌液1 mL離心收集菌體,重懸于SDS-PAGE上樣緩沖液中,充分打散后沸水浴 10 min,離心去上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況,方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.7 重組菌株原核表達(dá)條件的優(yōu)化

1.7.1 溫度

將重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4按照 1%接種量分別接種到1個(gè)含100 mL LB液體培養(yǎng)基(含Kan 30 mg/L和Cam 34 mg/L)三角瓶中,于37℃條件下培養(yǎng)至 OD600為 0.5時(shí)加入 IPTG使其終濃度為 1.0 mmol/L,后將菌液均分為5份,分別于25、28、31、34和37℃誘導(dǎo)6 h。

1.7.2 IPTG濃度

將重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4按照 1%接種量分別接種到1個(gè)含140 mL LB液體培養(yǎng)基(含Kan 30 mg/L和Cam 34 mg/L)三角瓶中,于37℃條件下培養(yǎng)至OD600為0.5時(shí)均分為7份,加入IPTG使其終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L,37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.7.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)

將重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4按照 1%接種量分別接種到7個(gè)含20 mL LB液體培養(yǎng)基(含Kan 30 mg/L和Cam34 mg/L)的三角瓶中, 37℃條件下培養(yǎng)至 OD600分別為 0.27、0.35、0.43、0.51、0.59、0.67和0.75,加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol/L,37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.7.4 誘導(dǎo)時(shí)間

將重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4按照 1%接種量分別接種到1個(gè)含20 mL LB液體培養(yǎng)基(含Kan 30 mg/L和Cam 34 mg/L)的三角瓶中,于37℃條件下培養(yǎng)至 OD600為 0.5,加入 IPTG使其終濃度為 1.0 mmol/L,37℃繼續(xù)培養(yǎng),分別于加入IPTG后的1、2、3、4、5、6、7、8 和 24 h 取樣。

1.7.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

用紫外分光光度計(jì)和Gel-pro Analyzer 4.5軟件分析蛋白樣和電泳圖譜,得到總蛋白含量和重組蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 p28a-CYP4表達(dá)載體PCR和酶切檢測(cè)結(jié)果

由圖1可以看出,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,得到大小約為1500bp和5200bp的兩個(gè)片段,與預(yù)期結(jié)果一致;PCR結(jié)果得到與目的片段大小相符的產(chǎn)物;測(cè)序結(jié)果顯示CYP4基因開(kāi)放閱讀框連接正確,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒p28a-CYP4。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切及PCR檢測(cè)Fig.1 Identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion and PCR

2.2 CYP4基因在Rosetta中的原核表達(dá)

由圖2中可以看出,Rosetta/p28a-CYP4重組菌株誘導(dǎo)后在56.0 kDa處有1條顯著表達(dá)條帶,與軟件預(yù)測(cè)大小相一致,表明中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因?qū)崿F(xiàn)在E.Coli中的表達(dá)。

2.3 重組菌株原核表達(dá)條件優(yōu)化

2.3.1 溫度對(duì)CYP4基因表達(dá)的影響

由圖3和圖4可知,25 ℃誘導(dǎo)菌體總蛋白含量最高,為 46.41 g/L,而目的蛋白僅占總蛋白含量的14.72%;37 ℃誘導(dǎo)時(shí)目的蛋白含量達(dá)到7.93 g/L,占總蛋白的25.50%。

圖2 重組菌株Rosetta/28a-CYP4誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.2 Induced expression of Rosetta/28a-CYP4 analyzed by SDS-PAGE

圖3 Rosetta/p28a-CYP4在不同溫度誘導(dǎo)下表達(dá)的 SDSPAGE分析Fig.3 Expression of Rosetta/28a-CYP4 induced at different temperatures analyzed by SDS

2.3.2 IPTG濃度對(duì)CYP4基因表達(dá)的影響

由圖5和圖6可知,當(dāng)IPTG濃度為0.8 mmol/L時(shí)菌體總蛋白最高,為 39.0 g/L,此時(shí)目的蛋白為9.95 g/L,占總蛋白的 25.51%;當(dāng) IPTG濃度為 1.2 mmol/L時(shí),菌體目的蛋白達(dá)到14.32 g/L,占總蛋白的52.41%。

圖4 不同溫度誘導(dǎo)條件下Rosetta/p28a-CYP4蛋白含量變化Fig.4 Variation of protein contents of Rosetta/28a-CYP4 induced at different temperatures

圖5 Rosetta/p28a-CYP4 在不同 IPTG濃度誘導(dǎo)下的SDS-PAGE分析Fig.5 Expression of Rosetta/28a-CYP4 induced with different concentrations of IPTG analyzed by SDS

2.3.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)CYP4基因表達(dá)的影響

圖7、圖8所示為菌液不同OD值誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)差異。由圖中可知,當(dāng)菌液OD600為0.75時(shí)誘導(dǎo)菌體總蛋白含量最高,為 46.74 g/L,此時(shí)目的蛋白占總蛋白的 20.88%;當(dāng) OD600為 0.59時(shí),目的蛋白含量達(dá)到10.33 g/L,占總蛋白的25.51%。

2.3.4 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CYP4基因表達(dá)的影響

由圖9和圖10可以看出,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的推移,菌體總蛋白含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),在5 h達(dá)到37.73 g/L,此時(shí)目的蛋白占總蛋白的23.05%;誘導(dǎo)6 h時(shí)總蛋白為34.72 g/L,目的蛋白則為8.86 g/L,占總蛋白的25.51%,達(dá)到最大值。

圖6 不同IPTG誘導(dǎo)條件下Rosetta/p28a-CYP4蛋白含量變化Fig.6 Variation of protein contents of Rosetta/28a-CYP4 inducted with different IPTG concentrations

圖7 Rosetta/p28a-CYP4不同OD600誘導(dǎo)SDS-PAGE分析Fig.7 Expression of Rosetta/28a-CYP4 induced at different OD600

3 討論

3.1 中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因的原核表達(dá)

圖8 不同時(shí)機(jī)誘導(dǎo)Rosetta/p28a-CYP4蛋白含量變化Fig.8 Variation of protein contents of Rosetta/28a-CYP4 induced at different OD600

圖9 Rosetta/p28a-CYP4不同誘導(dǎo)時(shí)間SDS-PAGE分析Fig.9 Expression of Rosetta/28a-CYP4 inducted at different time

圖10 不同誘導(dǎo)時(shí)間Rosetta/p28a-CYP4蛋白含量變化Fig.10 Variation of protein contents of Rosetta/28a-CYP4 induced at different times

細(xì)胞色素P450是機(jī)體對(duì)內(nèi)、外源物質(zhì),尤其是藥物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的重要酶系,作為細(xì)胞色素 P450最古老的家族之一,CYP4基因在許多海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)[9],且在海洋軟體動(dòng)物Mytilus edulis微粒體中檢測(cè)到了其在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)[11],而有關(guān)海洋甲殼動(dòng)物CYP4基因功能的研究卻十分有限。除了參與外源物質(zhì)的代謝以外,CYP4基因在節(jié)肢動(dòng)物荷爾蒙代謝中也起著重要作用[4]。Aragon等[12]發(fā)現(xiàn)CYP4C15基因在小龍蝦(Orconectes limosus)Y-器官中顯著表達(dá),提示該基因可能參與了蛻皮激素的生物合成。研究P450基因的結(jié)構(gòu)是了解其在生物體生長(zhǎng)發(fā)育及內(nèi)外源物質(zhì)代謝所起功能的重要環(huán)節(jié)。

作者構(gòu)建了中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因重組載體p28a-CYP4,并首次實(shí)現(xiàn)該基因在大腸桿菌的原核表達(dá)。張寶等[13]將CYP3A4基因同時(shí)接入 pET- 22b(+)、pET-28b(+)和 pET-32a(+)3種載體中,結(jié)果只有pET-32a(+)-CYP3A4可以表達(dá)目的蛋白,該蛋白大約占細(xì)菌總蛋白的40%。本研究表明pET28a載體可以實(shí)現(xiàn)中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因的表達(dá),且目的蛋白占總蛋白的含量可以達(dá)到50%以上,說(shuō)明pET28a是有效的CYP4基因表達(dá)載體。關(guān)樺楠等[14]克隆了青楊脊虎天牛(Xylotechus rusticus)CYP4G2基因片段并在E.Coli中實(shí)現(xiàn)原核表達(dá),SDS-PAGE電泳檢測(cè)到一條22.0 kDa大小的外源蛋白表達(dá)。李秀蘭等[15]將淡色庫(kù)蚊(Culex pipieus)CYP4E2r6基因構(gòu)建重組載體,在BL21中實(shí)現(xiàn)原核表達(dá),外源蛋白大小約為 42.0 kDa。中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因編碼蛋白質(zhì)全長(zhǎng)512氨基酸,表達(dá)蛋白大小為 56.0 kDa左右,與淡色庫(kù)蚊CYP4E2r6表達(dá)蛋白大小接近,大于青楊脊虎天牛CYP4G2表達(dá)蛋白,說(shuō)明CYP4基因在不同物種之間差異較大。

3.2 Rosetta/p28a-CYP4原核表達(dá)條件的優(yōu)化

重組菌體的蛋白表達(dá)量受到誘導(dǎo)劑濃度、接種量、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等諸多因素的影響。

董元凌等[16]在進(jìn)行家蠶CYP337A1基因的原核表達(dá)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo) 1～2 h隨時(shí)間推移目的蛋白含量增加,而2 h后隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),目的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異;在誘導(dǎo)溫度的比較上發(fā)現(xiàn),溫度為 25 ℃時(shí),誘導(dǎo)表達(dá)蛋白量較低,溫度為 32 ℃和37 ℃時(shí),表達(dá)量較高但蛋白量差異不明顯;IPTG濃度為 0.6 mmol/L時(shí)目的蛋白占總蛋白含量最高,而當(dāng)IPTG濃度大于0.6 mmol/L時(shí),其誘導(dǎo)表達(dá)量不受IPTG變化的影響,認(rèn)為這是由于 IPTG對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有一定的抑制作用導(dǎo)致[17]。潘濱等[18]在進(jìn)行煙草曲莖病毒復(fù)制相關(guān)蛋白基因的原核表達(dá)條件優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn),IPTG濃度 0.5 mmol/L時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高,隨著IPTG濃度增加目的蛋白表達(dá)量有下降趨勢(shì),誘導(dǎo)時(shí)間以4 h為宜,過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響蛋白的積累量。岳盈盈等[19]實(shí)現(xiàn)了風(fēng)疹病毒包膜糖蛋白E1的原核表達(dá)并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度及表達(dá)時(shí)間均對(duì)重組蛋白有較大的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)及時(shí)間均可影響重組蛋白及菌體總蛋白的表達(dá)量。37 ℃誘導(dǎo)時(shí)菌體目的蛋白含量最高,與上述研究結(jié)果一致。IPTG對(duì)目的蛋白占總蛋白含量的影響最為顯著,IPTG為1.2 mmol/L時(shí),目的蛋白占總蛋白含量最高,與之前的研究結(jié)果并不一致,可能是由于表達(dá)菌株、重組載體不同導(dǎo)致。誘導(dǎo)時(shí)間則對(duì)目的蛋白的含量影響最為明顯,誘導(dǎo)5 h時(shí)目的蛋白含量最高,其后呈下降趨勢(shì),與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]。

通過(guò)條件優(yōu)化認(rèn)為重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4的最佳誘導(dǎo)溫度為 37 ℃,最佳 IPTG濃度為 1.2 mmol/L,最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)及誘導(dǎo)時(shí)間分別為 0.59和 6 h。中國(guó)對(duì)蝦CYP4基因的原核表達(dá)對(duì)進(jìn)一步在蛋白水平上研究該基因的功能具有一定意義。

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