韋信賢,童桂香,謝宗升,黎小正,吳祥慶,廖永志,黃國秋

(1.廣西漁業(yè)病害防治環(huán)境監(jiān)測和質量檢驗中心,廣西 南寧 530021; 2.上海海洋大學 水產與生命學院,上海 201306)

對蝦TSV是全球范圍內廣泛流行并嚴重威脅對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原體,其主要感染西半球對蝦養(yǎng)殖品種,如凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、大西洋白對蝦(Litopenaeus setiferus)、褐對蝦(Penaeus aztecus)和桃紅對蝦(Penaeus duorarum),其中對凡納濱對蝦特別敏感。它引起的對蝦Taura綜合征(Taura syndrome,簡稱 TS) 被世界動物衛(wèi)生組織列為必須申報的疾病[1]。該病在1992年厄瓜多爾Taura河附近的對蝦養(yǎng)殖場最早發(fā)現(xiàn),1998年傳至中國臺灣,自2000年在中國多省市大規(guī)模暴發(fā),病死率高達60%～90%,給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2]。隨著對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,集約化程度的提高,對蝦生活環(huán)境日益惡化,TS成為近年來制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的幾種病毒性疾病之一。

病毒學研究證實,TSV是一種小的正二十面體無囊膜病毒,直徑 30～32 nm,其基因組為單正鏈RNA,由10205個核苷酸組成[3-4]。傳統(tǒng)的TSV檢測方法有指示生物法、組織病理學檢查、核酸點雜交和原位雜交、免疫組化及RT-PCR等,這些方法只能進行定性檢測,不能定量,且操作繁瑣。20世紀末發(fā)展起來的熒光定量 PCR技術,具有快速、靈敏、可準確定量等特點,被廣泛應用于病原體的檢測[5]。近幾年來熒光定量PCR的各種探針技術得到了快速發(fā)展,其中 TaqMan-MGB探針憑借其技術優(yōu)勢在動物病原體的檢測中得到了廣泛的應用[6-7]。TaqMan-MGB探針即在探針的 3′端連上不發(fā)光的淬滅基團MGB(Minor Groove Binder,簡稱 MGB)結合物,提高探針Tm值,使高Tm值的探針的長度縮短,便于設計,尤其對富含AT序列的探針設計有很大幫助。此外,TaqMan-MGB探針可以提高配對與非配對模板間的 Tm 值差異,且在探針 3′端不 發(fā)光的Quencher基團與 Report基團在空間的位置更接近,故 TaqMan-MGB探針雜交的穩(wěn)定性大大提高,實驗的結果更精確,分辨率更高[8]。為了提高 TSV 檢測的效率和準確性,縮短檢測周期,本研究擬應用TaqMan-MGB探針法建立一種能用于TSV快速定量檢測的一步法熒光定量 RT-PCR方法,為 TSV的流行病學及快速診斷等方面提供技術平臺。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

Line-Gene熒光定量 PCR檢測系統(tǒng)(FQ-33A)為杭州博日科技有限公司產品。pGM-T載體購自北京天根生化科技有限公司; 總RNA極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司; One Step PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)購自大連寶生物工程有限公司; T7體外轉錄試劑盒購自Fermentas公司; 質粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠快速回收DNA試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司; DNaseⅠ購自華美生物公司。

1.2 毒株與臨床樣品

TSV陽性材料為本實驗室從北海某養(yǎng)殖場的凡納濱對蝦中鑒定并保存。103份凡納濱對蝦樣品采集時間為2009～2010年,其中2010年的樣品由廣西水產技術推廣總站提供。

1.3 熒光定量PCR方法的建立

1.3.1 引物與TaqMan-MGB探針的設計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的TSV序列,并參考本實驗室對 TSV廣西株的測序結果(EU543262),選取衣殼蛋白基因的保守序列,采用Primer Express 2.0 軟件按熒光定量PCR引物和MGB探針設計的基本原則,設計特異的擴增引物和 TaqMan-MGB探針,擴增產物長度為 118bp,探針的 5′端標記熒光染料FAM,3′端標記MGB基團。由上海基康生物技術有限公司合成,臨用時稀釋至5 μmol/L。其序列為：

上游引物：5′- GATTGGGATATCATTCATCAAGATTGT 3′

下游引物：5′- GCCTGCTAACCCAGTTGAAAT-3′

探針：5′-FAM-ATTAGTCCTCCACTGGTTGTMGB-3′

1.3.2 病毒RNA提取

取 30 mg對蝦的鰓組織,按照上海飛捷生物技術有限公司的 RNAfast200總 RNA極速抽提試劑盒說明書進行RNA提取。用核酸蛋白分析儀測定核酸的濃度及純度,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標準品的制備

本研究所用的標準品為本實驗室構建的含有目的擴增片段的質粒經(jīng)體外轉錄所獲得的RNA。用檢測TSV 的水產行業(yè)標準[9]中的PCR引物(正向引物：5′-ATCGCTGCACTACTCGGA-3′和反向引物5′-TCGTACTGGCTGTTCATC-3′)擴 增 TSV RNA,擴增產物長度為 231 bp。產物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、純化,連入pGM-T載體,轉化到大腸桿菌DH5α,挑取單個克隆子,通過PCR、測序鑒定,證實目的基因正確克隆入pGM-T載體中。提取質粒DNA,37℃SalⅠ單酶切過夜,使質粒線性化,瓊脂糖凝膠電泳及試劑盒回收純化質粒DNA線性化產物,用于體外轉錄。按試劑盒說明加入反應試劑,37℃作用2 h,加1 μL DNaseⅠ酶消化轉錄產物中未轉錄的DNA,37℃20 min,70℃滅活DNaseⅠ酶15 min,用苯酚、氯仿抽提,乙醇沉淀、干燥后加DEPC水溶解轉錄的RNA,紫外分光光度計測RNA濃度和純度,D260nm定量濃度,并轉換成拷貝數(shù)[10]：拷貝數(shù)=濃度×阿伏加德羅常數(shù)/(一個堿基對的平均分子質量×總長度),阿伏加德羅常數(shù)為 6.02×1023。以 10倍梯度稀釋的 RNA作為標準品,-80℃保存?zhèn)溆?用已知拷貝數(shù)的標準品為模板進行一步法熒光定量RT-PCR。標準品的拷貝數(shù)分別為 2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101拷貝/μL。

1.3.4 引物和探針濃度的篩選

應用標準品 RNA作為模板,將引物終濃度在0.1～0.8 μmol/L、探針終濃度在 0.05～0.3 μmol/L 之間進行不同濃度的配比進行一步法熒光定量 RT-PCR,選擇引物和探針的最佳濃度組合。

1.3.5 退火溫度的優(yōu)化

退火溫度參考引物合成軟件計算的Tm值,在引物Tm值～62℃范圍內以1℃的梯度進行RT-PCR擴增。以標準品RNA為陽性對照,無菌蒸餾水為空白對照。根據(jù)定量RT-PCR擴增曲線Ct值及擴增曲線形狀確定最佳退火溫度。

1.4 標準曲線的建立與敏感性試驗

用含有目的擴增片段的質粒經(jīng)體外轉錄所獲得的 RNA作標準品,10倍系列稀釋后進行熒光定量PCR,每個梯度做3個平行。

1.5 特異性試驗

以健康的SPF凡納濱對蝦組織RNA及廣西TSV毒株的 RNA為模板,進行一步法熒光定量 RT-PCR擴增,檢測引物和探針的特異性。

1.6 重復性試驗

以梯度稀釋的標準品RNA為模板,每個梯度做3個平行,并在間隔第7天和第14天分別進行重復試驗,每次試驗記錄 Ct值,經(jīng)過數(shù)據(jù)分析得到組內及組間的變異系數(shù),檢測方法的重現(xiàn)性。變異系數(shù)=標準偏差/平均數(shù)。

1.7 一步法熒光定量RT-PCR的臨床應用

利用建立的一步法熒光定量RT-PCR方法對103份臨床樣品進行檢測,并將檢測為陽性的樣品送大連寶生物工程有限公司測序驗證,評價方法的臨床實用性及近年來TS在廣西的流行情況。

2 結果

2.1 體外轉錄RNA標準品的制備

重組質粒經(jīng) PCR、測序鑒定(GenBank登錄號EU543262),證實目的基因已正確連接入 pGM-T載體,體外轉錄的標準品RNA用紫外分光光度計測濃度和純度,D260nm/D280nm為 1.96,能滿足標準品的要求。

2.2 引物、探針濃度組合的篩選

應用標準品 RNA作為模板,以引物終濃度為0.5 μmol/L、探針終濃度分別為 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 μmol/L進行一步法熒光定量RT-PCR,探針終濃度為0.2 μmol/L時Ct值最小,且可獲得典型的S狀擴增曲線(圖1); 以探針終濃度為0.2 μmol/L、引物終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L進行一步法熒光定量RT-PCR,曲線形狀及 Ct值均無明顯差異,但引物終濃度為0.4 μmol/L時Ct值最小(圖2)。綜合以上結果,選探針終濃度0.2 μmol/L、引物終濃度 0.4 μmol/L為一步法熒光定量RT-PCR的最佳組合。

圖1 不同探針濃度熒光定量RT-PCR檢測TSV的擴增曲線Fig.1 Amplification plot using different concentrations of probe

2.3 退火溫度的優(yōu)化結果

退火溫度高于60℃時,定量PCR擴增曲線線形平坦,甚至不出現(xiàn) PCR擴增的對數(shù)增長期; 當退火溫度在58～60℃,可以得到較好的PCR擴增曲線,且隨著溫度的變化曲線變化不大; 溫度低于 58℃時,PCR的反應效率下降。因此,考慮到Taq酶在60℃時具有最好的 5′-3′外切酶活性,為確保檢測的靈敏性與特異性,退火溫度選擇60℃。

圖2 不同引物濃度熒光定量RT-PCR檢測TSV的擴增曲線Fig.2 Amplification plot using different concentrations of primer

2.4 熒光定量PCR的反應條件

優(yōu)化后的反應體系如下：2×one step RT-PCR buffer 12.5 μL,Ex Taq HS 酶(5 U/μL) 0.5 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL,RNase inhibitor 0.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各 1μL,TaqMan-MGB 探針(5 μmol/L) 1 μL,RNA 2.5 μL,用滅菌DEPC水補足25 μL,同時設不加RNA模板的空白對照。反應條件按照試劑盒說明并進行優(yōu)化,反轉錄反應：42℃ 15 min,95℃ 2 min; PCR 反應：94℃預變性30 s; 然后按94℃變性10 s、60℃退火延伸35 s進行45個循環(huán); 最后于30℃結束反應。

2.5 標準曲線的建立與敏感性試驗

以 10倍系列稀釋的 TSV標準品 RNA(2×107～2×101拷貝/μL)為模板使用優(yōu)化后的一步法熒光定量RT-PCR進行擴增,標準品的擴增曲線呈現(xiàn)明顯的 S型(圖 3),而空白對照沒有出現(xiàn)任何擴增。反應的動力學范圍可以達到7個數(shù)量級,標準品RNA為2×107拷貝時,Ct值最小,約為14; 標準品RNA為20拷貝時,Ct值約為35。因此,檢測靈敏度為20個病毒粒子,在實際檢測中以Ct值35為界限,若檢測樣品的Ct值≤35,且有“S”型擴增曲線,則檢測樣品判斷為 TSV陽性,否則樣品判斷為 TSV陰性。利用Line-Gene熒光定量 PCR數(shù)據(jù)分析軟件進行分析可得標準曲線：Ct=-3.40lgX+38.68,橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標代表 Ct值,相關系數(shù)和標準誤差分別為0.999和0.011,模板濃度的對數(shù)與Ct值之間呈良好的線性關系(圖 4)。以上結果顯示,本研究建立的標準曲線能夠準確地反映目的產物的擴增。

圖3 10倍梯度稀釋的標準品擴增曲線Fig.3 Amplification plot of 10-fold serially diluted RNA assay for the detection of TSV

圖4 TSV定量RT-PCR反應的標準曲線Fig.4 Standard curve for quantification of TSV using real-time RT-PCR

2.6 一步法熒光定量RT-PCR的特異性

以健康的SPF凡納濱對蝦組織RNA及廣西TSV毒株的RNA為模板,進行一步法熒光定量RT-PCR擴增,發(fā)現(xiàn)僅TSV RNA有“S”型擴增曲線,而SPF凡納濱對蝦組織RNA及空白對照沒有出現(xiàn)擴增,表明引物和探針的特異性較好(圖5)。

2.7 一步法熒光定量RT-PCR的重現(xiàn)性

以梯度稀釋的標準品RNA為模板,每個梯度做3個平行樣,共進行3次試驗,每次試驗記錄Ct值,經(jīng)過數(shù)據(jù)分析得到組內及組間的變異系數(shù),見表1。組內的實驗變異系數(shù)為0.32%～1.84%,組間實驗變異系數(shù)為0.79%～2.71%,表明試驗的重復性和重現(xiàn)性都很好,結果穩(wěn)定可靠。

圖5 熒光定量RT-PCR法檢測TSV特異性的擴增曲線Fig.5 Specificity of real-time RT-PCR assay for the detection of TSV

2.8 臨床應用

用一步法熒光定量RT-PCR方法檢測2009～2010年收集的103份凡納濱對蝦樣品,在檢測過程中,分別以TSV 標準品RNA、滅菌DEPC水、SPF對蝦組織RNA作為陽性對照、空白對照、陰性對照。結果發(fā)現(xiàn),有 6份樣品出現(xiàn)“S”型擴增曲線,其余樣品無擴增曲線。6份陽性樣品的Ct值介于18.56～33.71,根據(jù)標準曲線計算出反應體系中的病毒量約為 8.3×105～29拷貝/反應,計算蝦體中的病毒量約為3.3×105～12拷貝/μL RNA。

表1 MGB定量RT-PCR反應的Ct、組內及組間變異系數(shù)Tab.1 Ct,intra and inter-assay coefficient values of the real-time RT-PCR for the detection of TSV

3 討論

TSV自2000年以來一直是嚴重威脅中國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原體,其快速診斷方法如普通PCR、套式PCR、多重PCR及定量PCR技術近年來也相繼報道[11-15]。相比而言,熒光定量 PCR技術具有快速、靈敏、可準確定量的特點,應用于 TSV的檢測具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢。Dhar等[14]2002年就報道了采用SYBR GreenⅠ染料法對TSV進行定量檢測,但由于SYBR GreenⅠ可以與所有的雙鏈DNA結合,其與雙鏈DNA的結合只具有結構特異性而不具有序列特異性,使試驗容易產生假陽性信號會影響定量的精確性。鑒于TSV檢測的特異性在口岸進出口對蝦快速檢驗檢疫的重要性,岳志芹等[15]隨后建立了特異性更高的Taqman探針法檢測TSV。近年來,隨著熒光定量PCR技術的不斷改進與完善以及新的熒光化學物質的不斷開發(fā),TaqMan-MGB探針、TaqMan-LAN探針、Allglo探針等各種新型探針技術相繼涌現(xiàn),大大方便了研究工作者在實際的工作中依靈敏度、特異性等方面的不同實驗要求選擇合適的探針。

鑒于臨床診斷及檢驗檢疫實際工作對TSV檢測需快速、特異、靈敏的要求,本研究根據(jù) TSV基因組的保守序列,設計了 TaqMan-MGB探針,既繼承了靶序列由引物和探針雙重控制的探針法優(yōu)勢,保證了特異性; 又提高了探針的 Tm 值和配對與非配對模板間的Tm值差異,使探針的長度縮短、雜交穩(wěn)定性提高,從而能提高反應的擴增效率及靈敏度。本實驗還對反應條件中退火溫度、引物濃度、探針濃度等條件進行了優(yōu)化,確定了一步法熒光定量RT-PCR的最佳反應體系與反應參數(shù); 且標準曲線的制作是以將PCR產物克隆到pGM-T載體中并進行體外轉錄合成的RNA作為標準品,能準確地反映反轉錄及擴增的效率。實驗表明,該方法對TSV RNA的檢測靈敏度高,可達 20個拷貝,在 2×101拷貝/μL≤TSV RNA≤2×107拷貝/μL的范圍內具良好的線性關系; 與 SPF對蝦組織的 RNA沒有反應,特異性好;通過反復對該方法變異系數(shù)的檢測,證實該方法的重復性和重現(xiàn)性好; RT-PCR和產物分析的全過程均在單管封閉條件下一步完成,減少了交叉污染的風險,且不需要電泳、染色,僅需2 h可觀察結果,因此更方便、快速,充分發(fā)揮了熒光定量 PCR及TaqMan-MGB探針技術的簡便、快速、特異、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)勢。應用一步法熒光定量 RT-PCR方法對2009～2010年收集的103份來自廣西沿海不同對蝦養(yǎng)殖場的對蝦樣品進行檢測,結果僅檢出6份陽性,說明近年來TSV在廣西沿海地區(qū)養(yǎng)殖對蝦中的流行趨勢已有明顯減弱。筆者經(jīng)與廣西、廣東、上海等地的養(yǎng)殖戶交流,得知近年來許多具有紅體癥狀的病蝦經(jīng)檢測多為白斑綜合征病毒或細菌感染所致,TSV檢出率很低,表明近年來 TSV在國內的流行的確有所減弱。

此外,筆者在多年的熒光定量 PCR實驗經(jīng)歷中發(fā)現(xiàn),雖然熒光定量PCR為集PCR擴增和產物分析于一體的全封閉反應,無須 PCR后處理,可以減少污染發(fā)生的機會; 但如果長期檢測某一目的基因或常用目的片段的克隆質粒作為陽性對照時發(fā)生 PCR污染的幾率將大大增加。因此,為控制污染,在進行熒光定量 PCR試驗時,除嚴格按照相關實驗室操作規(guī)范進行外,每次試驗都應設定陽性對照與空白對照,監(jiān)控PCR反應體系是否污染。

在定量PCR反應中,Ct值是指每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。因此,利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出標準曲線,將未知樣品的Ct值代入標準曲線即可計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。在本實驗中,標準曲線為：Ct=-3.40lgX+38.68,儀器顯示標準曲線的相關系數(shù)為-0.999,誤差為0.011,根據(jù)Ex=10/K－1[16](Ex表示擴增效率,K指標準曲線中的斜率,在此為 3.40),經(jīng)過計算得到PCR擴增效率約為1.941,表明建立的PCR反應體系條件合適,有較高的擴增效率,能保證定量結果的可靠性。

與原有的TSV檢測方法相比,TaqMan-MGB探針一步法熒光定量RT-PCR法具有簡便、快速、能定量、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點,對可疑的 TSV樣品在2 h內可作出定性和定量的檢測和鑒定。該法的建立將為臨床快速診斷TSV、TS流行病學調查以及口岸進出口對蝦的快速檢驗檢疫提供更加敏感和特異的檢測方法,具有重要的臨床應用價值。

[1]世界動物衛(wèi)生組織(OIE).水生動物疾病診斷手冊第三版[M].國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局譯.北京：中國農業(yè)出版社,2000：165-171.

[2]Lightner D V,Redman R M.Shrimp diseases and current diagnostic methods[J].Aquaculture,1998,164(3)：201-220.

[3]Bonami J R,Hasson K W,Mari J,et al.Taura syndrome of marine penaeid shrimp：characterization of the viral agent[J].J Gen Virol,1997,78(2)：313-319.

[4]Mari J,Poulos B T,LightnerD V,et al.Shrimp Taura syndrome virus：genomic characterization and similarity with members of the genus cricket paralysislike viruses[J].J Gen Virol,2002,83(4)：915-926.

[5]Heid C A,Stevens J,Livak K J,et al.Real time quantitative PCR[J].Genome Res,1996,6(10)：986-994.

[6]張秀娥,田夫林,李希友,等.TaqMan MGB探針實時檢測兔病毒性出血癥病毒[J].中國獸醫(yī)學報,2007,27(6)：814-817.

[7]麻麗丹,巴中華,郝陶光,等.Taqman MGB探針實時PCR快速檢測副溶血性弧菌[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2009,32(1)：39-42.

[8]Afonina I,Zivarts M,Kutyavin I,et al.Efficient priming of PCR with short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder[J].Nucleic Acids Res,1997,25(13)：2 657-2 660.

[9]中華人民共和國農業(yè)部.SC/T 7204.3-2007,對蝦桃拉綜合征診斷規(guī)程[M].北京：中國農業(yè)出版社,2007：2.

[10]Santhosh S R,Parida M M,Dash P K,et al.Development and evaluation of SYBR GreenⅠ-based one-step real-time RT-PCR assay for detection and quantitation of Japanese encephalitis virus[J].Virol Methods,2007,143(1)：73-80.

[11]黃新新,莫勝蘭,陸承平.RT-PCR法檢測我國東南沿海凡納濱對蝦的桃拉綜合征病毒[J].中國病毒學,2005,20(5)：546-548.

[12]謝芝勛,龐耀珊,鄧顯文,等.多重RT-PCR同時檢測鑒別三種對蝦病毒的研究與應用[J].病毒學報,2005,21(5)：393-396.

[13]韋信賢,黎小正,吳祥慶,等.Taura綜合癥病毒RT-PCR檢測方法的改進及應用[J].上海水產大學學報,2008,15(5)：526-528.

[14]Dhar A K,Roux M M,Klimpel K R.Quantitative assay for measuring the Taura syndrome virus and yellow headvirus load in shrimp by real-time RT-PCR using SYBR Green chemistry[J].Journal of Virological Methods,2002,104(1)：69-82.

[15]岳志芹,劉葒,梁成珠,等.對蝦 Taura綜合癥病毒Taqman實時定量 RT-PCR檢測方法的建立與應用[J].中國預防獸醫(yī)學報,2008,30(2)：141-144.

[16]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method[J].Methods,2001,25(4)：402-408.