張定華 白世平 張克英 丁雪梅 吳彩梅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所,教育部抗病營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,雅安 625014)

2007年 3月,美國(guó)發(fā)生了“寵物毒糧”事件[1],2008年中國(guó)發(fā)生了“三鹿奶粉”事件,隨后在雞蛋中檢測(cè)出了三聚氰胺(MEL)。農(nóng)業(yè)部隨即組織開展了飼料中 MEL限量制定工作,中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第 1218號(hào)規(guī)定飼料原料和飼料產(chǎn)品中 MEL的限量值為 2.5m g/kg。MEL可被某些微生物在體內(nèi)降解為三聚氰酸(CYA),加劇 MEL的毒性[2]。MEL或 CYA單獨(dú)使用對(duì)動(dòng)物的毒性較小[1,3-4]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,大劑量 MEL(125～2 000mg/kg)會(huì)對(duì)蛋雞的肝臟和腎臟產(chǎn)生一定損傷。MEL和 CYA合用會(huì)在貓和狗腎臟中形成不溶于水的大分子復(fù)合物,并形成晶體甚至結(jié)石,存在于腎小管中不易被排出,阻塞腎小管,最終導(dǎo)致腎衰竭[1,3-4]。有研究發(fā)現(xiàn),在動(dòng)物腎小管中,MEL和 CYA會(huì)以 3∶1的比例形成晶體復(fù)合物[5],但 MEL與 CYA合用對(duì)蛋雞的毒性作用迄今未見報(bào)道。有關(guān) M EL和 CYA以 3∶1的比例添加的毒性效應(yīng)以及飼糧 CYA的存在是否會(huì)加劇 MEL毒性,目前在家禽上未見報(bào)道。本研究以蛋雞為試驗(yàn)動(dòng)物,旨在考察低劑量 MEL和CYA對(duì)蛋雞的毒性效應(yīng),為相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MEL(分析純,純度≥99.5%)購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司,CYA(分析純,純度 ＞99%)購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

本試驗(yàn)共設(shè) 7個(gè)組,每組 9個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)2只雞。組 1為對(duì)照組,飼喂基礎(chǔ)飼糧,組 2～4分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加 MEL 5、15和 30mg/kg的飼糧,組5～7分別飼喂在組 2～4的飼糧中添加CYA 1.667、5和 10 mg/kg的飼糧,以保持 MEL和 CYA比例為 3∶1(表 1)。試驗(yàn)期 35 d,1～21 d,所有組飼喂相應(yīng)的試驗(yàn)飼糧;22～35 d,每組中的6個(gè)重復(fù)換喂不含 MEL和 CYA的基礎(chǔ)飼糧,進(jìn)行消除試驗(yàn),其余 3個(gè)重復(fù)仍飼喂試驗(yàn)飼糧,繼續(xù)進(jìn)行殘留試驗(yàn)。

表 1 不同組飼糧中 MEL和 CYA的添加水平Table 1 Supp lemental levels ofmelam ine and cyanuric acid in the diets for different groups mg/kg

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧為玉米 -豆粕型飼糧,粉料,參考中國(guó)雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 33—2004)配制。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表 2。

表 2 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選用 126只 78周齡體重相近、產(chǎn)蛋率相近[(88.72±4.29)%]的羅曼粉殼蛋雞,在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。采用籠養(yǎng)、舍飼。預(yù)試 1周后進(jìn)入正試期。采用自然加人工光照(15 h/d),自由采食、飲水,定時(shí)清掃衛(wèi)生、噴霧消毒。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 血清生化指標(biāo)

于試驗(yàn)第 21天各組分別選取接近平均體重的 4只試雞,第 28天(消除試驗(yàn)第 7天)從每組做消除試驗(yàn)的重復(fù)中選 4只雞,以及第 35天繼續(xù)做殘留試驗(yàn)的重復(fù)中的 6只雞進(jìn)行翅下靜脈采血10m L,3 500 r/min離心 15 m in,分離血清,-20℃保存。采用日立 7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清肌酐(CRE,苦味酸法)和尿酸(UA,尿酸酶法)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT,酶法)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST,酶法)活性。

1.4.2 腎臟組織抗氧化酶活性和丙二醛含量

將試驗(yàn)第 21天、第 28天和第 35天(繼續(xù)做殘留試驗(yàn)的重復(fù))采血后的試雞頸部脫臼處死,放血。采集腎臟組織(約 0.2 g),用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量。

1.4.3 肝臟、腎臟組織切片

將試驗(yàn)第 21天、第 28天和第 35天(繼續(xù)做殘留試驗(yàn)的重復(fù))的試雞屠宰后,取部分肝臟、腎臟,用中性的 4%多聚甲醛固定。將固定的標(biāo)本經(jīng)水洗、透明、浸蠟、包埋等處理后,制成 5μm的切片,HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察病變情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用 SAS 8.0軟件 GLM程序進(jìn)行單因素方差分析,當(dāng)方差分析顯著時(shí),用 Duncan氏法進(jìn)行多重比較。以 P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 M EL和 CYA對(duì)蛋雞血清生化指標(biāo)的影響

由表 3可知,各組 21、35 d血清 AST、ALT活性和 CRE含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。但 21 d時(shí),血清 UA含量差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05),其中 15 mg/kg MEL和 5 mg/kg CYA組、30 mg/kg MEL和 10mg/kg CYA組顯著高于 0、5和15mg/kg MEL組,而 35 d UA含量接近顯著水平(P=0.059)。

消除 7 d后,各組血清 AST和 ALT活性、UA和CRE含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

2.2 MEL和 CYA對(duì)蛋雞腎臟抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

由表 4可知,各組 21、35 d腎臟 T-AOC、SOD活性和 MDA含量差異不顯著(P＞0.05)。28 d,各組腎臟 T-AOC、SOD的活性和 MDA含量均與對(duì)照組接近。

消除 7 d后,21和 35 d腎臟 T-AOC、SOD的活性和 MDA的含量得到了改善(P＞0.05),均接近對(duì)照組水平。

2.3 MEL和 CYA對(duì)蛋雞肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響

21 d時(shí),各組肝腎病變規(guī)律與 35 d相似,但35 d病變更為嚴(yán)重,因此,本文只列出 35 d病變結(jié)果。

MEL和 CYA對(duì)蛋雞肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響見圖 1。與對(duì)照組相比,單獨(dú)添加 5 mg/kg MEL組的病變不明顯(圖略),15和 30 mg/kg MEL組的肝臟輕度脂變,部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量圓形空泡(圖 1-B、圖 1-C)。同時(shí)添加 5 mg/kg MEL和1.667mg/kg CYA組、15mg/kg MEL和 5mg/kg CYA組的病變相似,均出現(xiàn)肝細(xì)胞輕度腫脹、水泡變性和脂肪變性的癥狀(圖 1-D、圖 1-E)。添加30 mg/kg MEL和 10 mg/kg CYA組的病變最為嚴(yán)重,肝細(xì)胞排列紊亂,肝索結(jié)構(gòu)不清,肝細(xì)胞漿中有較多的不規(guī)則或近圓形空泡(圖 1-F)。

圖 1 飼糧添加M EL和CYA對(duì)蛋雞肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of dietarymelam ine and cyanuric acid on liver structure of laying hens(400×)

MEL和 CYA對(duì)蛋雞腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響見圖 2。與對(duì)照組相比,單獨(dú)添加 5 m g/kg MEL組腎臟未見明顯病變(圖略)。15和 30mg/kg MEL組腎小管上皮細(xì)胞輕度空泡變性,后者腎小管間質(zhì)還有輕度淤血(圖 2-H和圖 2-I)。同時(shí)添加5mg/kg MEL和 1.667mg/kg CYA組、15mg/kg MEL和 5 mg/kg CYA組病變相似,均表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞腫脹、水泡變性(圖 2-J、圖 2-K)。30mg/kg MEL和 10 mg/kg CYA組病最嚴(yán)重,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,腎小球輕度充血(圖 2-L)。

?

消除 7 d后,各組肝臟和腎臟組織病變情況見圖 3。本文僅列出在 35 d時(shí)受損較嚴(yán)重的30 mg/kg MEL組、30 mg/kg MEL和 10 mg/kg CYA組經(jīng)消除試驗(yàn)后的結(jié)果。由圖 3可知,這 2個(gè)組的肝臟(圖 3-B和圖 3-C)、腎臟(圖 3-E和圖 3-F)與對(duì)照組相比,均無(wú)明顯病變。

圖 2 飼糧添加M EL和CYA對(duì)蛋雞腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects o f dietary melam ine and cyanuric acid on kidney structure of laying hens(400×)

圖 3 消除 7 d后蛋雞肝臟和腎臟的組織結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of liver and kidney of laying hens after elim ination for 7 days(200×)

3 討 論

3.1 M EL和 CYA對(duì)蛋雞肝臟功能的影響

血清 AST、ALT活性可反映肝臟功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明,單獨(dú)添加 MEL對(duì)血清 AST、ALT活性無(wú)顯著影響,與高春起等[6]的研究結(jié)果一致。但 Neerman等[7]給小鼠注射 40 mg/kg BW MEL 48 h后,血清 AST活性升高。其原因可能與本試驗(yàn) MEL給予方式與其不同或添加劑量低有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),單獨(dú)灌胃 MEL對(duì)小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)沒有明顯損傷[8]。本試驗(yàn)中 35 d肝臟切片結(jié)果顯示 MEL只造成輕度脂肪變性和空泡變性等輕微損傷,可能是由于肝臟并非 MEL的靶器官,因此低劑量的 MEL更不會(huì)對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p害。

謝志輝等[8]研究表明,給小鼠同時(shí)灌胃等量的 MEL、CYA(250、50、10 mg/kg BW)顯著提高了血清 AST和 ALT活性。本試驗(yàn)中 MEL和CYA合用對(duì)血清 AST和 ALT活性無(wú)顯著影響,但從 35 d的肝臟組織切片結(jié)果可知,MEL和 CYA合用對(duì)肝臟損傷程度大于分別單獨(dú)添加的效應(yīng)。

3.2 M EL和 CYA對(duì)蛋雞腎臟功能的影響

血清 CRE和 UA水平可反映腎臟功能。據(jù)林祥梅等[9]、李倜等[10]報(bào)道,貓和肉雞采食含有M EL的飼糧后,血清尿素氮(SUN)和 CRE含量超過(guò)正常水平。而 Puschner等[3]研究表明,單獨(dú)給予貓0.5%、1%的 MEL或 0.2%、0.5%、1%的CYA持續(xù) 10 d,對(duì) SUN、CRE無(wú)顯著影響(P＞0.05)。本試驗(yàn)中單獨(dú)添加 MEL對(duì)血清 UA、CRE沒有顯著影響(P＞0.05),可能因動(dòng)物種屬差異等不同所致。

腎臟 T-AOC、SOD活性可反映腎臟清除自由基的能力,而 MDA含量可反應(yīng)腎臟細(xì)胞受損的嚴(yán)重程度。本試驗(yàn)中單獨(dú)添加 MEL對(duì) 21、35 d腎臟T-AOC、SOD活性和 MDA含量無(wú)顯著影響(P＞0.05),這與高春起等[11]的報(bào)道不一致,說(shuō)明 MEL并未對(duì)蛋雞腎臟產(chǎn)生明顯氧化損傷。陳茜等[12]同時(shí)給小鼠灌胃 MEL和 CYA 250、50和 10mg/kg BW后,發(fā)現(xiàn)血清 CRE和腎臟 MDA含量升高,SOD活性降低,且呈劑量相關(guān)性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MEL與 CYA合用對(duì)血清 CRE和腎臟 MDA含量、SOD活性無(wú)顯著影響(P＞0.05),但提高了21 d血清 UA含量;35 d腎臟組織切片說(shuō)明 M EL和 CYA會(huì)造成腎臟損傷。另有研究發(fā)現(xiàn),貓?jiān)陲曃购?2.4%MEL的飼糧 30 d后,腎小管管腔中出現(xiàn)晶體[9]。給狗灌服含有 30 mg/kg BW MEL和10mg/kg BW CYA的藥物膠囊后,腎臟中有結(jié)晶形成,出現(xiàn)間質(zhì)性腎炎和脂肪細(xì)胞變性等病理變化[13]。本試驗(yàn)研究表明,MEL與 CYA合用對(duì)腎臟的毒害加劇,但未發(fā)現(xiàn)晶體。這可能是由動(dòng)物種屬差異、染毒方式不同,或 MEL和 CYA的添加劑量低于蛋雞腎臟晶體形成的閾值[14]所致。另外,生理生化指標(biāo)的變化和積累導(dǎo)致組織器官的病變,使機(jī)體產(chǎn)生病理癥狀[13]。本試驗(yàn)中,腎臟T-AOC、SOD活性和 MDA含量以及血清 CRE含量無(wú)明顯異常,卻觀察到腎臟組織病變,這可能是腎臟代償作用的結(jié)果。腎臟是機(jī)體內(nèi)代謝最旺盛的器官之一,在組織發(fā)生病變的同時(shí),腎臟可能正在或者已將不正常的指標(biāo)代謝至正常范圍內(nèi)[15]。

3.3 蛋雞換喂基礎(chǔ)飼糧后對(duì) MEL和 CYA毒性效應(yīng)的消除作用

MEL和 CYA在單胃動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行惰性代謝,大部以原體或同系物形式排出,二者在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期分別為4.04[16]和2.5 h[17]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),換喂基礎(chǔ)飼糧 7 d后,二者對(duì)蛋雞血清 UA及肝腎組織結(jié)構(gòu)的不利影響均可消除,并恢復(fù)到對(duì)照組水平,證實(shí)停止飼喂含 MEL和 CYA飼糧后,蛋雞可將體內(nèi)的 MEL、CYA排出體外,緩解或消除對(duì)機(jī)體的損傷。

4 結(jié) 論

①蛋雞飼糧添加 M EL和 CYA顯著影響 21 d血清 UA含量,同時(shí)添加 MEL和 CYA組血清 UA含量高于單獨(dú)添加 MEL組;肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度病變,且合用的毒性大于單獨(dú)添加的毒性。

②停止飼喂含 MEL和 CYA飼糧 7 d后,可以消除 MEL和 CYA的不利影響。

[1] BROWN C A,JEONG K S,POPPENGA R H,etal.Outbreaks of renal failure associated w ith melam ine and cyanuric acid in dogs and cats in 2004 and 2007[J].Journal of Veterinary D iagnostic Investigation,2007,19(6)：525-531.

[2] JUTZIK,COOK A M,HUTTER R.The degradative pathway of the s-triazine melam ine.The steps to ring cleavage[J].Biochem ical Journal,1982,208(3)：679-684.

[3] PUSCHNER B,POPPENGA R H,LOWENSTINE L J,et al.Assessment of melam ine and cyanuric acid toxicity in cats[J].Journal of Veterinary D iagnostic Investigation,2007,19(6)：616-624.

[4] REIMSCHUESSEL R,GIESEKERC M,M ILLER R A,etal.Evaluation of the renal effects of experimental feeding of melam ine and cyanuric acid to fish and pigs[J].American Journal o f Veterinary Research,2008,69(9)：1217-1228.

[5] WEI X,M INGDONG D,HENKJAN G,etal.Cyanuric acid and melam ine on Au(111)：structure and energetics of hyd rogen-bonded netw orks[J].Small,2007,3(5)：854-858.

[6] 高春起,武書庚,齊廣海,等.三聚氰胺對(duì)蛋鴨產(chǎn)蛋性能、血清指標(biāo)和肝腎組織結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(5)：1050-1056.

[7] NEERMAN M F,ZHANG W,PARRISH A R,et al.In vitro and in vivo evaluation of amelam ine dendrimer as a vehicle for drug delivery[J].International Journal of Pharmaceutics,2004,281(1/2)：129-132.

[8] 謝志輝,袁慧.三聚氰胺及三聚氰胺與三聚氰酸混合物對(duì)小鼠肝臟損傷的研究[EB/OL].[2011-04-01].http：//cpfd.cnki.com.cn/Article/CPFDTOTALZGXJ200908005130.htm.

[9] 林祥梅,王建峰,賈廣樂,等.三聚氰胺的毒性研究[J].毒理學(xué)雜志,2008,22(3)：216-218.

[10] 李倜,丁雪梅,張克英,等.飼糧中添加三聚氰胺對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能和健康的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22(6)：14-22.

[11] 高春起,武書庚,岳洪源,等.日糧三聚氰胺對(duì)產(chǎn)蛋鴨組織氧化損傷的影響[J].中國(guó)畜牧雜志,2010,46(13)：64-67.

[12] 陳茜,袁慧.三聚氰胺及其同系物三聚氰酸對(duì)小鼠腎臟組織細(xì)胞的損傷研究[EB/OL].[2011-04-01].http：//cpfd.cnki.com.cn/Article/CPFDTOTALZGXJ200910001055.htm.

[13] 李建紅,劉永杰,魏學(xué)良.三聚氰胺及其衍生物對(duì)比格犬腎臟和睪丸的毒性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)報(bào),2010,26(11)：7-12.

[14] 邵靜君,溫家琪,徐世文.三聚氰胺毒理學(xué)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2007,12：52-54.

[15] Anderson R A.A complementary approach to urolithiasis p revention[J].W orld Journal o f Uro logy,2002,20(5)：294-301.

[16] DOBSON R L M,MOTLAGH S,QUIJANO M,et al.Identification and characterization o f toxicity of contam inants in pet food leading to an outbreak o f renal toxicity in cats and dogs[J].Toxicological Sciences,2008,106(1)：251-262.

[17] CANELLIE.Chem ical,bacteriological,and toxicological p roperties of cyanuric acid and ch lorinated isocyanurates as applied to swimm ing pool disin fection：a review[J].American Journal of Public Health,1974,64(2)：155.