雷 蕾 高雪華 鄧小晨

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610064)

我國是世界第二大飼料生產(chǎn)國,其中蛋白質(zhì)飼料原料主要依靠進(jìn)口。事實(shí)上,我國油菜面積和產(chǎn)量居世界第一,菜籽粕(尤其是雙低菜籽粕)是一種優(yōu)良的植物蛋白質(zhì)飼料[1],由于其中存在硫代葡萄糖甙(glucosinolate,簡稱硫苷或硫甙)等致毒物質(zhì)以及植酸、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì),每年有700多萬 t菜籽粕資源未得到充分利用[2]。面對(duì)蛋白質(zhì)飼料原料價(jià)格不斷高漲的形勢(shì),菜籽粕的脫毒利用顯得尤為重要。

國內(nèi)外已對(duì)菜籽粕脫毒方法進(jìn)行了大量的研究,其中微生物脫毒法是當(dāng)前降低菜籽粕毒性最有效的方法。黑曲霉(Aspergillus niger)作為眾多菜籽粕脫毒微生物之一,在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生多種酶,包括植酸酶和芥子酶(myrosinase,EC 3.2.3.1),不但可以較好地降低植酸含量,還能有效降低硫甙含量。

關(guān)于菜籽粕脫毒利用方面的研究依賴于硫甙檢測技術(shù),研究者已經(jīng)開發(fā)出多種硫甙測定方法,包括重量法、比色法、色譜法等。高效液相色譜法準(zhǔn)確度高,但是要測定全硫甙,需要分析菜籽粕中完整的硫甙組成,備齊標(biāo)品系列,過程繁瑣且費(fèi)用較高[3];氯化鈀法色階較淺、易受干擾;內(nèi)源酶比色法由于酶源不統(tǒng)一,每次都需確定最佳酶解時(shí)間,且不同酶源對(duì)測定的穩(wěn)定性也會(huì)有影響[4]。除了直接測定完整硫甙外,其他方法都是通過硫甙的分解產(chǎn)物間接計(jì)算出硫甙的含量,這些方法都需要芥子酶的參與。以往國內(nèi)外的研究表明,已經(jīng)在一些植物、蚜蟲和微生物中檢測到芥子酶[5],但目前國內(nèi)關(guān)于芥子酶的研究主要是植物來源,對(duì)于微生物來源酶的研究也限于植物芥子酶基因在微生物中的克隆表達(dá)[6-7],從降解硫甙的微生物中提取芥子酶卻鮮有報(bào)道。

本研究首次利用從具有硫甙降解能力的黑曲霉中粗提的芥子酶,通過比色定糖的方法測定菜籽粕中硫甙含量。該方法操作簡單、粗酶提取容易,較使用菜籽粕或白芥子的內(nèi)源酶法測定更為穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

1.1.1 菌株

黑曲霉 H23為本實(shí)驗(yàn)室利用氯化鈀法[8]篩選的具有硫甙分解能力的菌株。1.1.2 10%菜籽粕水

稱取菜籽粕粉 10 g于 100 m L沸水中浸煮30 m in,冷卻至室溫后定容至 100 m L,離心,取上清液。5%菜籽粕水制作方法相同。

1.1.3 培養(yǎng)基

10%菜籽粕水、蛋白胨 0.2%、KH2PO40.1%、尿素 0.1%,自然 pH。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器

752紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠 )、超聲破碎儀(日本 Sanyo公司 )、AvantiTM30低溫臺(tái)式高速離心機(jī)(美國 BECKMAN公司)、HZQ-C空氣振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2.2 試劑

白芥子(德仁堂大藥房)、丙烯基硫甙標(biāo)品(Sigma)、3,5-二硝基水楊酸(DNS,分析純)、氯化鈀(成都普思生物科技有限公司)、復(fù)合酶液(糖化酶、果膠酶、纖維素酶含量分別 1%、1%、0.5%,成都普思生物科技有限公司)、0.02 mo l/m L Tris-HCl緩沖液 。

1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用 DNS定糖法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.4 粗酶液制備

黑曲霉孢子液 (1.0×106個(gè)/m L)按 1%(V/V)的接種量接入培養(yǎng)基中,于 30℃190 r/min振蕩培養(yǎng) 60 h,收集菌體并用雙蒸水清洗 3次,用0.02 mo l/m L Tris-HCl緩沖液懸浮沉淀,在冰浴中超聲破碎 15 m in(超聲 5 s,間歇9.9 s),完畢后用緩沖液定容至 15 m L,于 4℃10 000 r/m in離心 10 min,取上清液。

1.5 樣品預(yù)處理

分別取 1 m L粗酶液至 2支比色管中,將其中1支置于沸水浴中加熱10 min,冷卻至室溫,再在2支比色管中分別加入2μL 100 mg/m L氨芐溶液、100μL復(fù)合酶液、1 m L 5%菜籽粕水,置于37℃水浴鍋中保溫一段時(shí)間后蒸餾水定容。

1.6 硫甙測定

用 DNS定糖法測定預(yù)處理樣品吸光度(A)：A=A(E)-A(E′),式中,A(E)為未加熱樣品吸光度,A(E′)為加熱處理樣品吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖 1可得：硫甙(mg/g)=[(0.032 9+A)/13.81]×2.207×稀釋倍數(shù),式中,2.207是硫甙葡萄糖轉(zhuǎn)換為硫甙的系數(shù)。

圖 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

經(jīng)過粗酶液處理的菜籽粕,通過 DNS定糖法測得硫甙水解生成的葡萄糖量可由以下計(jì)算公式得到：

2.2 方法驗(yàn)證

在 1m L粗酶液中加入 100μL復(fù)合酶液,分別處 理 30、40、50、60 μL丙 烯基 硫甙 溶 液(2.99 mg/m L)3.5 h,定容后測定其吸光度,測定結(jié)果如表 1所示。

表 1 丙烯基硫甙標(biāo)準(zhǔn)品測定Table 1 Determ ination of allyl glucosinolate standard

粗酶與丙烯基硫甙反應(yīng)生成了葡萄糖,說明 該粗酶液確含芥子苷酶系。加入不同體積樣品后所得吸光度呈現(xiàn)一定梯度,計(jì)算值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.112 mg/m L,對(duì)測定結(jié)果做 t檢驗(yàn)：t(0.05,3)=2.746,t表(0.05,3)=3.182,t(0.05,3)＜t表(0.05,3),表明該方法測定菜籽粕水中硫甙含量可行。表 1中的計(jì)算結(jié)果比真實(shí)含量低,這是因?yàn)榇置钢械慕孀用肝催M(jìn)行分離純化。直接進(jìn)行細(xì)胞破碎、離心后得到的粗酶中含有一定的葡萄糖,存在一定的背景。

2.3 干擾因素排除

粗酶液包括黑曲霉所有胞內(nèi)酶,其中包括淀粉酶、果膠酶、纖維素酶。菜籽粕水中經(jīng)酶解后能生成還原糖的主要物質(zhì)有淀粉、果膠、可溶性纖維素和硫甙。因此,通過在所有測試組中都加過量的淀粉酶、果膠酶和纖維素酶來消除其他來源的還原性糖對(duì)測定結(jié)果的影響。

根據(jù)產(chǎn)品使用要求,將淀粉酶、果膠酶、纖維素酶粉分別配制成濃度為 1%、1%、0.5%的酶液以及復(fù)合酶液,在各自最適條件下處理菜籽粕水,測定其中干擾底物含量(表 2)。

表 2 干擾底物含量Table 2 Contents of interference substrates

果膠的基本結(jié)構(gòu)是半乳糖醛酸,纖維素的基本結(jié)構(gòu)是纖維二糖。按照淀粉與葡萄糖轉(zhuǎn)換系數(shù)的推算方法得到果膠、纖維素與葡萄糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)分別是 0.978 6、1.901 7,繼而通過各自分解產(chǎn)生的葡萄糖量得到相應(yīng)底物在菜籽粕水中的含量。

根據(jù)表 2中淀粉、果膠、纖維素底物的含量,配制含有相應(yīng)濃度淀粉、果膠、纖維素的混合溶液,取 1m L溶液分別用 1m L粗酶液和 100μL復(fù)合酶液在 37℃下水解 6 h。復(fù)合酶液分解溶液中物質(zhì)產(chǎn)生的葡萄糖的量(56.184 mg)大于粗酶液(31.129 mg),表明加入的復(fù)合酶活性明顯高于粗酶,可以通過在反應(yīng)體系中加入復(fù)合酶的方法來消除樣品中淀粉、果膠和可溶性纖維素分解產(chǎn)生的還原糖的影響。

2.4 反應(yīng)條件選擇

將反復(fù)洗滌后收集到的菌體分別采用超聲破碎和液氮研磨 2種處理方式制取粗酶,菜籽粕水分別取 0.5、1和 2m L,37℃水浴鍋中保溫 1～8 h后測定試樣的吸光度,以選擇粗酶制取方式和反應(yīng)時(shí)間(圖 2)。

圖 2 不同體積樣品在不同時(shí)間的吸光度Fig.2 Absorbance of sam p les with different vo lum es at different time

從圖 2可以看出,葡萄糖量在 1 h內(nèi)就快速增加 ,隨后增長速率相對(duì)減緩。加入菜籽粕水為2 m L時(shí),葡萄糖量在5h后基本穩(wěn)定。當(dāng)加入菜籽粕水為 1和 0.5m L時(shí),反應(yīng)在 3 h以后基本平穩(wěn)。通過超聲破碎獲得粗酶的反應(yīng)曲線較液氮研磨方法的平穩(wěn),而且超聲破碎較液氮研磨操作更為方便、標(biāo)準(zhǔn),研磨中易出現(xiàn)細(xì)胞破碎不均勻和粗酶污染。標(biāo)準(zhǔn)化的操作過程才能保證不同批次酶活的穩(wěn)定。菜粕水取 1和 0.5m L時(shí)的反應(yīng)曲線都較平穩(wěn),但由于本試驗(yàn)所用的移液槍量程為1 m L,取樣 1 m L比取樣 0.5 m L更能減小系統(tǒng)誤差,因此,本試驗(yàn)采用超聲破碎獲取胞內(nèi)酶,菜籽粕水取樣體積為 1m L,保溫時(shí)間為 3.5 h。

2.5 穩(wěn)定性分析

5種取自不同榨油坊的菜籽粕樣品,分別用微生物酶法、氯化鈀法[10]、內(nèi)源酶法(以白芥子為酶源)進(jìn)行多次重復(fù)測定,結(jié)果的變異系數(shù)見表 3。

表 3 不同測定方法樣品吸光度的變異系數(shù)Table 3 Coefficients o f variation o f sam ple absorbance by differentmethods %

從各種樣品多次測定的變異系數(shù)來看,微生物酶法測定的穩(wěn)定性優(yōu)于氯化鈀法,用微生物酶優(yōu)于用白芥子為酶源時(shí)的測定效果,而且不同白芥子之間測定數(shù)值的穩(wěn)定性也存在差異。氯化鈀法由于其色階較淺、易受干擾,所以穩(wěn)定性不如微生物酶法。雖然作為酶而加入的白芥子量很少,但其硫甙含量高,分別加入各管時(shí)的稱量誤差以及不同白芥子之間硫甙含量的差別是造成其測定穩(wěn)定性不如微生物酶法以及不同白芥子測定穩(wěn)定性不同的主要原因。

3 討 論

黑曲霉是眾多菜籽粕脫毒微生物之一,利用它發(fā)酵菜籽粕,不但可以較好地降低植酸含量,還能有效降低硫甙含量,這是由于其發(fā)酵過程產(chǎn)生的多種酶中包括了植酸酶和芥子酶。本試驗(yàn)從篩選到的 1株具硫甙降解能力的黑曲霉中提取胞內(nèi)芥子酶,建立了一種利用微生物酶測定菜籽粕中硫甙含量的方法。

作為一種優(yōu)良的植物蛋白質(zhì)資源,菜籽粕在脫毒、利用方面的研究依賴于硫甙檢測技術(shù)。目前存在很多硫甙及其降解產(chǎn)物的測定方法,這些方法都有各自的針對(duì)性和優(yōu)點(diǎn),可以根據(jù)不同需要進(jìn)行選擇,但是它們?cè)谀承┓矫婊蚨嗷蛏俅嬖谝恍┎蛔愫腿毕輀11]。DNS定糖法成熟、準(zhǔn)確性好、穩(wěn)定性高;微生物酶的使用,解決了內(nèi)源酶法操作難以標(biāo)準(zhǔn)化的問題,因此,微生物酶法是一種很好的硫甙測定方法。

以往的內(nèi)源酶法直接以是否加入新鮮的白芥子粉或菜籽粕粉來設(shè)計(jì)對(duì)照,沒有考慮酶自身的硫甙以及可能存在的糖化酶、纖維素酶等對(duì)測定結(jié)果的影響。因此,本方法就背景消除不徹底的問題在對(duì)照試驗(yàn)的設(shè)計(jì)上進(jìn)行了改進(jìn)。首先,對(duì)照組與試驗(yàn)組所加試劑種類和劑量一致,唯一差別是對(duì)照組所加酶液經(jīng)高溫滅活而試驗(yàn)組保存了酶活性,保證了雙方的一致性。其次,考慮了其他還原性物質(zhì)的影響,并通過外加復(fù)合酶來消除干擾,使測定結(jié)果更準(zhǔn)確。最后,也是本方法區(qū)別于其他方法最重要的一點(diǎn),就是使用的芥子酶是運(yùn)用細(xì)胞超聲破碎技術(shù)從具硫甙降解能力的黑曲霉中提取得到的,解決了其他內(nèi)源酶法因酶來源不一、操作難以規(guī)范化而造成的測定誤差和穩(wěn)定性方面的問題。菌株培養(yǎng)方式和粗酶提取過程的標(biāo)準(zhǔn)化,保證了酶源的穩(wěn)定和操作過程的標(biāo)準(zhǔn)化,使本方法比原有方法更加穩(wěn)定,也為其他方法的優(yōu)化改進(jìn)提供了參考。

芥子酶催化硫甙葡萄糖苷水解的產(chǎn)物異硫代氰酸鹽有抗癌、防止微生物繁殖、降低血壓、間接抗氧化作用等功效[12],因此,對(duì)微生物來源芥子酶的純化、性質(zhì)以及提高產(chǎn)酶量的進(jìn)一步研究很有意義。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種微生物酶測定菜籽粕中硫甙含量的方法,其穩(wěn)定性高于內(nèi)源酶法,為硫甙測定方法的研究、微生物芥子酶的利用提供了新思路。

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