魏德泳 朱偉云 毛勝勇

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室,南京 210095)

乳酸是瘤胃內(nèi)一類重要的中間產(chǎn)物,大多瘤胃微生物如牛鏈球菌和乳酸桿菌均可發(fā)酵谷物類飼料并產(chǎn)生乳酸,而乳酸利用菌如埃氏巨球型菌等則可利用乳酸生成丙酸,因此,維持較低水平的乳酸對(duì)維持乳酸利用菌的數(shù)量和瘤胃正常生理功能具有積極的意義。同時(shí),適當(dāng)濃度的乳酸還有利于減輕瘤胃內(nèi)硝酸鹽的毒理效應(yīng)[1]。但當(dāng)動(dòng)物飼糧突然從青粗飼料轉(zhuǎn)變成高谷物飼料時(shí),瘤胃內(nèi)乳酸濃度會(huì)顯著升高,瘤胃 pH持續(xù)下降,導(dǎo)致乳酸利用菌的生長(zhǎng)被抑制,乳酸產(chǎn)生菌群和利用菌群之間正常的平衡受破壞,大量乳酸會(huì)在瘤胃中累積,導(dǎo)致 pH進(jìn)一步降低,從而引發(fā)瘤胃急性酸中毒。在瘤胃中,微生物產(chǎn)生的乳酸有 D-和L-乳酸之分,動(dòng)物機(jī)體組織中含有大量能氧化L-乳酸的酶,而 D-乳酸必須經(jīng)過體組織內(nèi)線粒體膜才能被氧化,因此,D-乳酸降解慢,其毒性更大。推測(cè)D-乳酸可能是造成瘤胃急性酸中毒和宿主代謝性酸中毒的根本原因[2-3]。但瘤胃中到底哪些微生物是主要的 D-、L-乳酸產(chǎn)生菌,目前相關(guān)報(bào)道極少。在我國(guó),隨著近年來牛羊養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,發(fā)生瘤胃酸中毒的報(bào)道也不斷增多。為了解我國(guó)本土動(dòng)物瘤胃內(nèi)產(chǎn)乳酸菌的種類,闡明其產(chǎn) D-、L-乳酸的特性,本試驗(yàn)利用本地山羊,從瘤胃中分離獲取主要的乳酸菌,在此基礎(chǔ)上研究其產(chǎn) D-、L-乳酸的能力,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)這些微生物在瘤胃消化中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物選擇 3頭裝有永久性瘤胃瘺管的體況良好的雄性長(zhǎng)江三角洲白山羊。飼糧精粗比例為 6∶4,預(yù)試期 2周。第 1周將山羊的飼糧精料添加量從 200 g/d逐漸增加到 400 g/d,飼糧精料由70%玉米和 30%豆粕組成,自由采食羊草;第 2周精料添加量保持為 400 g/d,自由采食羊草。

1.2 培養(yǎng)基成分及其配制

乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基(MRS)組成：蛋白胨 10 g,牛肉浸膏 10 g,酵母浸膏 5 g,葡萄糖 20 g,檸檬酸三銨2 g,CH3COONa 5 g,K2HPO45 g,M gSO4?7H2O 0.5 g,MnSO4? 4H2O 0.2 g,吐溫 -80 1 g,瓊脂粉 15 g,加蒸餾水至 1 L,調(diào)節(jié)pH至 5.5～6.2,115℃高溫滅菌 15 min,待培養(yǎng)基的溫度降至 60℃后制備平板備用。

1.3 產(chǎn)乳酸菌的富集與分離純化

在預(yù)飼 2周后,采集 3頭山羊的混合瘤胃內(nèi)容物,并保存于保溫瓶?jī)?nèi)。瘤胃液經(jīng)過 4層紗布過濾去除固相,取 1m L瘤胃液接種至10m LMRS液體厭氧培養(yǎng)基內(nèi),39℃富集培養(yǎng)。間隔 24 h以1%(V/V)的接種量傳代 1次,連續(xù)傳代 5次。取第 5代培養(yǎng)物 0.1 m L進(jìn)行 10倍梯度稀釋,取 3個(gè)梯度的樣品 0.1 m L涂布于 MRS平板培養(yǎng)基上,置于厭氧工作站培養(yǎng) 48 h后,在菌落密度合適的平板上挑取形態(tài)、顏色等不同的菌落,繼續(xù)劃線培養(yǎng)至菌落形態(tài)單一。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)特征觀察

菌體經(jīng)稀釋后涂布于平板上,于厭氧工作站中 39℃培養(yǎng),48 h后觀察菌落形態(tài)。

1.4.2 生理生化特性鑒定

生理生化特性鑒定方法參考東秀珠等[4]的方法進(jìn)行,所用微量發(fā)酵管購(gòu)自浙江杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4.3 分離菌株 DNA提取、PCR擴(kuò)增及16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

各菌株體外培養(yǎng) 24 h后,收集菌體,用于DNA的提取,DNA提取和 16S rRNA序列擴(kuò)增方法分別參照 Murray等[5]和 Zoetendal等[6]的方法進(jìn)行。所用細(xì)菌 16S rRNA全長(zhǎng)通用引物序列如下：上游引物 8f[5′CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG 3′],下游引物 1510r(5′GTGAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT 3′)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min,而后 94℃30 s,52℃30 s,68℃ 1.5 m in,30個(gè)循環(huán),68℃最終延伸 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),片段長(zhǎng)度正確的 PCR產(chǎn)物送至南京丁貝生物技術(shù)有限公司測(cè)序。本試驗(yàn)所測(cè)菌株 16S rRNA基因序列在 GenBank的登錄號(hào)分別為HQ452822、 HQ452821、 HQ452823、 HQ452824、HQ452825、HQ452826。從 GenBank中獲取與之有較高同源性的模式菌株的 16S rRNA基因序列。采用 Clustalx(1.81)和 MEGA(4.0)軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,利用鄰接(neighbor-joining)法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 生長(zhǎng)曲線與 D-、L-乳酸的測(cè)定

取 1m L復(fù)壯的分離菌株置于 9m L的 MRS液體厭氧培養(yǎng)基中,以不接種培養(yǎng)基為對(duì)照,每間隔 2 h測(cè)定接種試管中培養(yǎng)液的吸光度(OD)值,測(cè)定波長(zhǎng)為 600 nm,繪制各產(chǎn)乳酸菌生長(zhǎng)曲線。采用試劑盒(購(gòu)自上海必優(yōu)公司)測(cè)定培養(yǎng) 24 h后各菌株發(fā)酵液中 D-、L-乳酸濃度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用 SPSS 18.0軟件包中的 One-way ANOVA進(jìn)行單因素分析,均值的多重比較采用 Duncan氏法進(jìn)行,以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分離與形態(tài)學(xué)特征

利用涂板劃線分離技術(shù),盡可能挑取菌落形態(tài)、顏色不相同的細(xì)菌,經(jīng)連續(xù)分離純化,最終獲得 6株乳酸產(chǎn)生菌,分別命名為 L2、L3、L5、L8、L10和 L12。革蘭氏染色鑒定表明,L2、L5、L8和L10為革蘭氏陰性菌;L3和 L12為革蘭氏陽性菌。形態(tài)學(xué)觀察表明,L2、L5、L8和 L10的形態(tài)相近,單個(gè)細(xì)菌呈球狀或橢圓狀,多聚集在一起,成鏈狀;L3和 L12的形態(tài)相近,呈短桿狀或橢圓形,皆比較濕潤(rùn),有光澤,光滑,邊緣整齊。

2.2 分離菌株的生化特征

各菌株的生化特征如表 1所示。L8和 L10菌株可利用木糖、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖和乳糖,但不能利用葡萄酸鹽和山梨醇;L3和 L12菌株能利用纖維二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、葡萄酸鹽、麥芽糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、水楊苷、蔗糖、阿拉伯糖和山梨醇,但不能利用木糖、七葉靈、半乳糖和核糖;L2菌株可利用木糖、纖維二糖 、七葉靈 、半乳糖 、葡萄糖、乳糖、麥芽糖 、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、水楊苷、蔗糖和阿拉伯糖,但不能利用葡萄酸鹽、山梨醇和核糖;L5菌株可利用木糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、水楊苷、蔗糖和阿拉伯糖,但不能利用七葉靈、葡萄酸鹽和山梨醇。

表 1 生化鑒定結(jié)果Table 1 The results of biochem ical identification

2.2.3 菌株 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

由表 2可見,L2、L8、L10與牛鏈球菌(Streptococcus bovis)的 16S rRNA的相似性達(dá) 99%,L5與馬鏈球菌(Streptococcus equinus)相似性高達(dá)99%,L3、L12與食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)相似性達(dá) 99%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,L2、L8、L10和 L 5位于同一簇群內(nèi),屬鏈球菌屬;而 L3與L12位于另一簇群內(nèi),屬魏斯氏菌屬。

表 2 分離菌株 16S rRNA基因序列與 Genbank已知菌序列的相似性比較Table 2 Comparison of sim ilarity o f 16S rRNA gene sequence in iso lated strains with know n species in GenBank

2.3 生長(zhǎng)曲線

各分離菌株生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示,除 L2與L12,其余 4株乳酸產(chǎn)生菌均在接種后 2 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,L5和 L10菌株在接種后 8 h左右進(jìn)入平臺(tái)期,其余菌株在接種后 10 h左右入平臺(tái)期。

2.4 菌株產(chǎn) D-、L-乳酸的測(cè)定

由表 3可見,6株產(chǎn)乳酸菌中,L2產(chǎn) L-乳酸量最高,顯著高于其他各組(P＜0.01),其他菌株產(chǎn) L-乳酸量均達(dá)到 14 mmol/L以上。L3、L5和L12產(chǎn) D-乳酸產(chǎn)量較高,達(dá) 14mmol/L以上,而L2、L8和 L10菌株產(chǎn) D-乳酸量較低,其中 L8產(chǎn)D-乳酸量最低,僅 0.083mmol/L。

圖 1 分離菌株的 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequence of isolates

圖 2 各菌株生長(zhǎng)曲線Fig.2 The grow th curves o f the isolated strains

3 討 論

反芻動(dòng)物瘤胃微生物在飼糧降解過程中起著重要作用,當(dāng)飼糧中精料比例較高時(shí),瘤胃中主要產(chǎn)乳酸菌包括牛鏈球菌、馬鏈球菌、乳桿菌、棲瘤胃擬桿菌和雙岐桿菌,其中牛鏈球菌最為常見。據(jù)報(bào)道,在全牧草飼糧條件下,瘤胃中牛鏈球菌數(shù)量在 104～107CFU/g,但在以谷物類飼糧為主時(shí),其數(shù)量可達(dá)到 1011CFU/g,而這主要?dú)w因于鏈球菌具有較其他瘤胃微生物更快的生長(zhǎng)速度[7]。本研究分離到的6株產(chǎn)乳酸菌中,3株為牛鏈球菌屬,從生長(zhǎng)曲線結(jié)果可見,3株鏈球菌的生長(zhǎng)速度很快,在 10 h內(nèi)全部進(jìn)入平臺(tái)期,說明在以葡萄糖等單糖為底物的條件下,這些菌具有較快的生長(zhǎng)速度,是山羊瘤胃中的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)乳酸菌。馬鏈球菌也是一類常見于動(dòng)物消化道內(nèi)的重要腸道菌,該菌可發(fā)酵淀粉類多糖生成乳酸,本研究從山羊瘤胃中分離獲得 1株馬鏈球菌,結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)牛鏈球菌與馬鏈球菌是瘤胃中 2類主要的乳酸產(chǎn)生菌。魏斯氏菌屬(Weissella)是一類廣泛分布于發(fā)酵食物(如臘腸、泡菜)、土壤等環(huán)境中的微生物,屬乳酸菌群(lactic acid bacteria),與乳酸桿菌(Lactobacillus)十分相似,通過形態(tài)及生化鑒定很難將其完全區(qū)分。據(jù)報(bào)道,目前該屬中僅見分離于人類或其他動(dòng)物的融合魏斯菌、食物魏斯菌,尚無在反芻動(dòng)物瘤胃中分離獲得食竇魏斯氏菌的報(bào)道[8]。本試驗(yàn)首次從瘤胃中分離到 2株食竇魏斯氏菌,生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示這 2株菌也具有較高的生長(zhǎng)速度,在接種后 10 h內(nèi)進(jìn)入平臺(tái)期。此外,其產(chǎn) L-與 D-乳酸的都量很高,此結(jié)果也說明該菌株可能是山羊瘤胃中另一類主要的產(chǎn)乳酸菌。

表 3 分離菌株產(chǎn) D-、L-乳酸濃度Tab le 3 Concentrations o f D-and L-lactate p roduced by iso lated strains mmol/L

乳酸桿菌是一類常見于單胃動(dòng)物胃腸道中的產(chǎn)乳酸菌,但其在反芻動(dòng)物瘤胃中數(shù)量不高,在本研究中我們未分離到乳酸桿菌。據(jù)報(bào)道,乳酸桿菌僅在瘤胃 pH低于 4.5時(shí)才成為主要的優(yōu)勢(shì)菌,而在亞臨床酸中毒時(shí),瘤胃中主要的產(chǎn)乳酸菌為牛鏈球菌[9-10]。在本研究中,所用試驗(yàn)動(dòng)物未達(dá)到瘤胃酸中毒狀態(tài)。結(jié)果說明,在常規(guī)補(bǔ)飼精料情況下,瘤胃中主要的可培養(yǎng)產(chǎn)乳酸菌可能為牛鏈球菌、馬鏈球菌和食竇魏斯氏菌。

如前言所述,瘤胃微生物發(fā)酵所產(chǎn)乳酸主要包括 L-與 D-乳酸,其中 L-乳酸可被埃氏巨球菌、棲瘤胃擬桿菌等利用生成揮發(fā)性脂肪酸,而D-乳酸難以被直接代謝,因此 D-乳酸可能是導(dǎo)致瘤胃 pH下降的主要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn),所分離 6株細(xì)菌中,食竇魏斯氏菌產(chǎn)D-乳酸的量最高,而所分離的鏈球菌中,僅 L5所產(chǎn) D-乳酸量達(dá)到 14 mmol/L,結(jié)果說明,食竇魏斯氏菌可能是瘤胃中主要的產(chǎn) D-乳酸的微生物,但由于該菌是首次在瘤胃中分離獲得,有關(guān)該菌在瘤胃中具體分布及功能情況尚不清楚,待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上可知,本試驗(yàn)從山羊瘤胃中分離獲得 6株產(chǎn)乳酸菌,生化與分子鑒定結(jié)果均表明山羊瘤胃中主要的產(chǎn)乳酸菌是牛鏈球菌、馬鏈球菌與食竇魏斯氏菌,且以產(chǎn)混合型乳酸為主。

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