鄭 萍 田 剛 毛湘冰 余 冰 張克英 陳代文

(四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所,動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室,雅安 625014)

一氧化氮(NO)是由一氧化氮合成酶(NOS)以精氨酸為底物合成的內皮細胞衍生舒張因子[1-3]。NO在各種生理過程中均起著重要的作用,包括調節(jié)上皮細胞正常功能,維持血管舒張狀態(tài),削弱血小板激活和血栓的形成,阻止平滑肌增殖,抑制白細胞黏附及白細胞滲出,維持血細胞和血漿蛋白的滲透壓屏障[4-6]以及營養(yǎng)物質的代謝[7]等。作為 NOS的底物,精氨酸可以調節(jié) NOS的活性,進而調節(jié) NO的合成,從而影響營養(yǎng)物質的代謝。依賴于精氨酸的 NO代謝途徑的發(fā)現(xiàn)引起了人們對 NO的生物化學、生理學和營養(yǎng)學等方面的研究的極大興趣。關于 NO對營養(yǎng)物質代謝的影響,目前的研究主要集中在人的糖尿病、肥胖癥、高血脂癥或動物模型中NO對葡萄糖、脂肪、氨基酸代謝的影響等方面。本文擬就 NO及其與養(yǎng)分代謝調節(jié)的研究進展做一綜述。

1 NO的合成

NO是由 NOS在輔助因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黃素單核苷酸(FMN)、四氫生物喋呤(BH4)、Ca2+和鈣調蛋白的作用下將精氨酸氧化分解而產生的[4,7]。如圖 1所示,NOS的黃素蛋白將 NADPH的電子轉運給血紅素,血紅素活化并結合分子氧,BH4與 NOS緊緊結合,緊挨著血紅素,將底物精氨酸氧化分解為瓜氨酸和 NO[8]。BH4在 NOS的反應中起結構和氧化還原的作用。

圖 1 NOS催化反應Fig.1 Catalytic reaction by NOS[9]

NOS有 3種亞型,神經型(nNOS)——最早在神經組織中發(fā)現(xiàn);誘導型(iNOS)——最早在巨噬細胞和肝細胞中由體外誘導發(fā)現(xiàn);內皮型(eNOS)——最早在內皮細胞中發(fā)現(xiàn)[9]。nNOS和eNOS在各種類型的細胞中低水平地表達,iNOS正常情況下在大多數(shù)細胞中不表達,而受細菌毒素和炎癥因子的誘導高度表達[10]。它們廣泛存在于細胞的細胞膜、細胞質、細胞核、粗面內質網和線粒體中。

NOS的亞型分別由 3種不同的基因編碼,其核苷酸序列有 51%～57%的同源性。NOS有 N端氧化酶和 C端還原酶 2個結構域。N端氧化酶結構域包含了精氨酸、血紅素、BH4的結合位點和將 L-精氨酸連接到 C端還原酶結構域的鈣調蛋白識別位點,C端還原酶結構域包含了 FAD、FMN、NADPH的結合位點,如圖 2所示。

圖 2 NOS的區(qū)域結構圖Fig.2 The structural domain of NOS[11]

2 NO與營養(yǎng)物質代謝

NO不僅是脈管系統(tǒng)中重要的內皮衍生因子,而且在營養(yǎng)物質代謝調控上有著重要的作用。目前研究較多的是在人的糖尿病、肥胖癥、高血脂癥患者或動物模型中 NO對葡萄糖、脂肪、氨基酸代謝的影響方面。

2.1 NO與葡萄糖代謝

在糖尿病人或是實驗動物模型上的研究表明,給予 NO合成底物后,能使患者或是糖尿病鼠的血糖濃度歸于正常。在用鏈唑霉素誘導的糖尿病鼠模型上的研究表明,添加 NO的合成底物精氨酸后,顯著增加了 NO的產量,并使糖尿病鼠的血糖濃度歸于正常[12]。給人和大鼠注射 NG-硝基 -L-精氨酸甲基酯(L-NAME,NOS競爭性抑制劑)可以降低胰島素分泌,降低葡萄糖耐量[13-16]。給四氧嘧啶誘導的糖尿病大鼠飼喂富含精氨酸的椰子核蛋白 45 d后發(fā)現(xiàn),椰子核蛋白能顯著降低糖尿病大鼠血清中葡萄糖和胰島素的水平,肝臟糖原水平和血清碳水化合物代謝酶的活性回復到正常的水平,降低了糖尿病相關的胰腺損傷[17]。

Horton等[18]研究表明,在體外培養(yǎng)的大鼠肝細胞中,添加 NO的供體增加 NO的產量后,能抑制乳酸鹽和丙酮酸鹽轉化成葡萄糖,并且葡萄糖的合成量隨著 NO產量的增加呈劑量依賴的方式減少。Sprangers等[19]用分離大鼠肝細胞進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn) NO能夠降低糖原合成酶的活性,從而抑制葡萄糖轉化為糖原。這些體外試驗說明 NO能抑制肝臟葡萄糖和糖原的合成。在分離的大鼠骨骼肌細胞培養(yǎng)液中添加硝普鈉(SNP,一氧化氮供體)后發(fā)現(xiàn),葡萄糖轉運增加[20-21],骨骼肌細胞表面葡萄糖轉運載體 4(GLUT4)的濃度隨著 NO產量的增加而增加[22]。而在培養(yǎng)液中加入 NG-甲基 -L-精氨酸(L-NMMA,NOS競爭抑制劑)后,NOS的表達受到抑制,進而抑制 NO的合成,而此時發(fā)現(xiàn)因肌肉鍛煉刺激引起的葡萄糖轉運減少[20]。在培養(yǎng)的 3T3-L1脂肪細胞中,添加 SNP促進葡萄糖的吸收,而用 NO清除劑或腺苷環(huán)化酶抑制劑處理后,葡萄糖的吸收降低到基礎水平[23],說明 NO刺激葡萄糖吸收是通過 cGMP的途徑。給大鼠灌注 L-NMMA后,顯著降低了脂肪組織中葡萄糖的轉運[24]。說明在骨骼肌和脂肪組織中,增加 NO的產量能增加葡萄糖的轉運和吸收,抑制NO的生成則降低葡萄糖的轉運和吸收。

關于 NO調節(jié)葡萄糖轉運和吸收的信號途徑,總結目前的研究,歸納起來可能有 2條途徑。第一,依賴胰島素的途徑。在骨骼肌中,胰島素能促進葡萄糖的吸收。胰島素是通過磷酸化磷脂酰肌醇 -3激酶(PI3K)來促進葡萄糖吸收的,抑制了PI3K的活性(采用其抑制劑渥曼青霉素 wortmannin)后,就極顯著抑制了胰島素刺激的葡萄糖的吸收,顯著抑制了 NO刺激的葡萄糖吸收[22],說明NO刺激的葡萄糖吸收是部分依賴胰島素途徑的。第二,不依賴胰島素的途徑。鍛煉能增加大鼠肌纖維膜 GLUT4的含量及脈管 NO的產量[25-26],增加大鼠骨骼肌 eNOS和 iNOS的基因表達、蛋白質含量和活力[20,27-28],注射 L-NAM E后會鈍化這種作用[29]。L-NMMA處理后,可以抑制 NOS的表達,減少因肌肉鍛煉刺激引起的葡萄糖轉運[20]。但鍛煉時對 PI3K活性無影響,說明鍛煉時 NO對肌肉葡萄糖的轉運作用不受胰島素的影響。另外有研究表明,活化 AMPK可促進骨骼肌葡萄糖的轉運,增加 NOS的表達,而添加 L-NAME后抑制了 AMPK的促葡萄糖轉運[30],說明 AMPK調節(jié)的骨骼肌葡萄糖轉運是依賴 NO的。

關于NO對葡萄糖氧化分解的作用研究結果不一致。用 SNP處理培養(yǎng)的大鼠比目魚肌細胞,發(fā)現(xiàn)乳酸鹽分泌量和葡萄糖氧化以劑量依賴的方式增加[31-33]。而在培養(yǎng)的大鼠肝細胞上,NO通過減少葡萄糖激酶和甘油醛 -3-磷酸脫氫酶的活性也能減少肝細胞糖酵解[34-35]。

高濃度的葡萄糖也會影響 NOS的活性和 NO的產量。在人臍靜脈上皮細胞的研究表明,高葡萄糖濃度(33 mm ol/L)的培養(yǎng)基中,NO的合成量顯著降低;進一步研究表明,高葡萄糖抑制 eNOS的活性,補充精氨酸(800 mol/L)則抑制 eNOS活性的降低[36]。

2.2 NO與脂質代謝

NO參與脂肪組織的生物學反應,影響脂肪的合成和分解。脂肪細胞中的 NO由 eNOS和 iNOS合成,在脂肪細胞中不表達 nNOS基因或表達量很弱[37]。肥胖癥病人脂肪組織中 iNOS基因表達和NO產量較正常人高[38]。肥胖癥病人的 eNOS基因的表達也增加,但高產量的 NO主要是因為iNOS。NO對脂肪代謝的作用根據(jù) NO的來源、供體、組織位點和細胞內的氧化 -還原狀態(tài)不同而異[39-41]。體外試驗的研究結果表明,在同一細胞中,不同的細胞狀態(tài),NO對脂肪代謝的調節(jié)作用不同。大鼠脂肪細胞在低濃度的喘息平(isoprenaline)處理時,添加嗎多明(molsidomine)或 SNP可促進脂解;高濃度的喘息平處理時,添加嗎多明或SNP則抑制脂解[42]。1～5μmol/L的 SNP促進肥胖癥人脂肪組織的脂肪分解,但 25～500μmol/L的 SNP抑制脂肪分解[43]。體內試驗研究表明,NO在不同組織中對脂肪代謝調節(jié)的作用不同。在 110日齡的公豬飼糧中補充 1%的精氨酸,可顯著增加肌肉中脂肪酸合成酶的基因表達,而降低脂肪組織中脂蛋白脂酶、GLUT4和ACC-α的基因表達;此外,補充精氨酸還會降低脂肪組織中激素敏感脂酶的基因表達[44],這個試驗說明補充精氨酸可以促進豬肌肉組織中脂肪沉積,而在脂肪組織中則促進脂肪分解。給成年ZDF大鼠補充 1.51%精氨酸鹽酸鹽,可以增加NO的產量(71%～85%),增加脂肪組織中脂肪分解(22%～24%),腹部和附睪體脂沉積分別降低了 45%和 25%[45]。給大鼠飼喂 0.02%的 L-Nω-硝基精氨酸(L-NNA,NOS抑制劑)8周后,發(fā)現(xiàn)大鼠體脂肪含量和血清甘油三酯含量顯著增加,而血清硝酸鹽的濃度顯著下降,并且,肝臟肉堿棕櫚酸轉移酶(脂肪氧化的限速酶)的活性受到抑制,但補充了 4%的精氨酸后,L-NNA的作用被消除[46]。大鼠上的研究表明,NO能夠調節(jié)脂肪組織中瘦素對脂肪分解的刺激作用[47]。

NO可抑制低密度脂蛋白的合成。給兔子飼喂含 0.03%SNP的飼糧,有降低兔子血漿低密度脂蛋白的趨勢;且在孵化的肝細胞中,添加 0.5%SNP可顯著降低 apoB的含量[48]。飼喂大鼠 NOS的抑制劑(L-NNA)后,血漿甘油三酯、膽固醇、極低密度脂蛋白水平顯著增加[46]。大鼠飼糧中添加0.02%NOS抑制劑(L-NNA)造成血漿脂肪酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白濃度顯著升高,飼糧中補充 4%的精氨酸后,由于 NOS抑制劑造成的高水平的血漿脂肪酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白濃度顯著下降[49]。NO調節(jié)肝細胞脂質代謝主要是通過抑制脂肪酸的從頭合成和乙酰輔酶 A羧化酶的活性,降低丙酰輔酶 A的水平,促進脂肪酸氧化的[50]。

2.3 NO與氨基酸代謝

關于 NO對氨基酸代謝影響的研究比較少。目前關于 NO對氨基酸氧化的報道結果不一致。有報道認為補充外源 NO(灌注 0.2 mmol/L的SNP)增加大鼠肝細胞尿素的生成,促進其氨基酸的氧化[51]。但是,與炎癥條件下高水平的 NO相比,生理水平的 NO通過活化過氧化物酶體增生物激活受體 -α(PPAR-α)降低尿素循環(huán)的酶的表達,抑制肝臟細胞尿素的合成,說明生理水平的NO有抑制肝臟氨基酸氧化的作用[52]。PPAR-α是肝臟尿素循環(huán)的負調節(jié)子,可下調氨甲酰磷酸合成酶 1、鳥氨酸氨甲酰轉移酶(OCT)、精氨基琥珀酸合成酶(ASS)和精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)的表達[52]。

在 TNF-α誘導的大鼠骨骼肌肌肉萎縮的模型上,NOS的抑制劑能促進肌球蛋白肌酸磷酸激酶(myosin creatinine phosphokinase,MCK)的活化,抑制肌肉萎縮。在骨骼肌中,iNOS來源的 NO調節(jié) TNF-α對蛋白質合成的抑制作用和刺激蛋白質降解[53]。在血管平滑肌細胞中,外源 NO供體(30～300μmol/L)抑制鳥氨酸脫羧酶,從而抑制多胺合成和細胞增殖[54],但在內皮細胞中,10μmol/L的 NO供體則增加多胺的合成和細胞增殖[55]。

3 NO合成的調控

NO影響營養(yǎng)物質的代謝調控,因此調節(jié) NO的產量就能調節(jié)營養(yǎng)物質的代謝。NO在生物體內由 NOS合成,細胞中 NO的合成速率可通過各種途徑控制精氨酸的有效性及NOS的輔助因子來調節(jié)[56]。

鈣調蛋白是 3種亞型的 NOS活化所必需的[57-58]。iNOS不依賴于 Ca2+,因為其結構與鈣調蛋白緊密相連;eNOS和 nNOS的活化需要高濃度的 Ca2+,它們與 iNOS的不同在于它們的 C端還原酶區(qū)域有一個含 40～50個氨基酸的基序,阻止其與鈣調蛋白結合。磷酸化作用可影響 eNOS和 nNOS的活性[59],但 iNOS的活性不受磷酸化調節(jié),而受炎癥刺激的調節(jié)[60]。精氨酸在催化 NOS二聚體的形成中起到結構性的作用[8,61]。精氨酸作為 NOS的底物,它還能通過底物調節(jié)相關聯(lián)酶活性的機制來調節(jié) NOS活性[62]。由于 NO的合成受細胞類型、Ca2+-鈣調蛋白、亞細胞位點、磷酸化作用以及底物精氨酸濃度等多種因素的影響和調節(jié),而目前對具體的信號傳導途徑與最終的作用區(qū)域之間的關系還不清楚,因此,對于體內NO的活性調節(jié)的研究仍然是巨大的挑戰(zhàn)。

4 小 結

精氨酸 -NO途徑在體內有著重要的生理功能。NO不僅參與體內營養(yǎng)物質代謝,而且是上皮衍生的作用于血管的一種調節(jié)介質。NO具有擴張血管、調節(jié)血流量、改善微循環(huán)及抗壞血小板聚集黏附及免疫調節(jié)功能,但 NO合成量過多會產生細胞毒性,所以,體內適量水平的 NO對于人和動物的健康是非常重要的[63-66]。

NO在生物體內有著重要的生理作用,NO的產量、來源、作用的位點等因素均影響其生物學功能,而 NO的合成量受到 NOS活性的直接調節(jié)。NOS的活性又受到多種因素的影響。人和動物模型研究表明,NO對人類高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、高血壓、慢性腎衰竭、慢性心臟衰竭及癌癥等疾病進程有著重要的調控作用。在養(yǎng)殖業(yè)生產上,動物常常遭受免疫應激或各種環(huán)境應激,在應激條件下,可能會誘導 iNOS的表達,合成大量的NO,產生細胞毒性,同時會造成精氨酸被耗竭,產生營養(yǎng)缺乏癥等疾病。所以,進一步研究 NO的作用機理、NOS的表達調控以及它與其他精氨酸代謝酶類和產物之間的交互關系有著重要的現(xiàn)實意義。

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