張 楠,朱維寧,蘇君藝,張林生

(西北農(nóng)林科技大學生命科學學院 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

植物在受到干旱、寒冷、鹽堿等非生物脅迫時體內(nèi)會被誘導產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合或間接作用于基因啟動子區(qū)域，調(diào)控一系列相關(guān)基因的表達，進而對植物體產(chǎn)生保護效應[1-2]。自從Paz-Ares等[3]首次克隆了玉米(Zeamays)的轉(zhuǎn)錄因子基因C1 以來，已有多種調(diào)控干旱、鹽漬、低溫等相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子基因被分離克隆。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，已經(jīng)有超過50個家族至少1 700個編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因被克隆出來[4-8]，其中一部分基因是與干旱脅迫相關(guān)[9-10]。例如：bZIP家族的AREB/ABF基因可以對干旱產(chǎn)生響應[11]，NAC基因家族的轉(zhuǎn)錄因子ANAC019、ANAC055和ANAC072則被干旱、高鹽和ABA誘導表達[12]，而AP2/ERF基因家族的DREB1亞家族轉(zhuǎn)錄因子通常被低溫誘導[13]。大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在植物對干旱、低溫、鹽堿、高溫等脅迫響應時啟動自身體內(nèi)自我保護系統(tǒng)方面有著重要的作用[14-17]。

扁穗冰草(Agropyroncristatum)是分布于干旱、半干旱及高寒地區(qū)的多年生牧草。扁穗冰草具有較強的抗旱、抗寒性，可作為干旱地區(qū)水土保持和綠化植物，生態(tài)價值較高[18-19]。目前，轉(zhuǎn)錄因子在整個冰草屬中的研究鮮見報道，本研究對已報道的一些禾本科植物的轉(zhuǎn)錄因子基因序列進行比對分析，根據(jù)核酸序列的保守區(qū)域設計引物，采用RT-PCR技術(shù)、半定量RT-PCR技術(shù)來研究扁穗冰草遇寒冷及干旱脅迫時的相關(guān)基因表達趨勢，以期為深入研究轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫下的細胞信號應答及作用機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1供試材料 扁穗冰草種子由西北農(nóng)林科技大學生命科學學院中心實驗室提供。

1.2試劑 RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自大連寶生物(TaKaRa)公司；pGEM-T Easy Vector 購自Promega公司；DNA分子Marker、凝膠回收試劑盒等購自北京天根公司；Taq DNA 聚合酶(2×taqmix)購自沃爾森公司，其他試劑均為分析純。

1.3RT-PCR克隆目的基因及半定量RT-PCR

1.3.1冷脅迫 扁穗冰草種子在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃蛭石培養(yǎng)，稱重法控制含水量，至地上部分高約20 cm時，分別置于4 ℃ 12 h、4 ℃ 24 h、4 ℃ 36 h、4 ℃ 60 h，后恢復至25 ℃12 h，采集各脅迫時期的冰草葉片。

1.3.2干旱脅迫 扁穗冰草種子在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃蛭石培養(yǎng)，稱重法控制含水量，至地上部分高約20 cm時，自然干旱至含水量為20%，然后分別在第1天、第3天、第5天、第7天及復水1 d時，采集各脅迫時期冰草葉片。

1.3.3RNA提取及半定量RT-PCR 參照Trizol 試劑的操作說明提取各脅迫處理時期的扁穗冰草葉片RNA,以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。RT產(chǎn)物于-20 ℃下保存。利用DNAMAN 對已報道在GenBank中的禾本科植物的cbf,dreb,myb轉(zhuǎn)錄因子進行比對，針對其保守區(qū)，使用Primer Premier 5.0設計3對引物(引物由上海生工合成)。選用扁穗冰草肌動蛋白基因ACβ-actin(GenBank登錄號：JN007031)作為內(nèi)標基因。通過預試驗探索確定半定量試驗條件(表1)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和回收純化后的目的產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector 連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109中,經(jīng)藍白斑篩選及菌落PCR鑒定后,送至上海桑尼公司測序。將目的片段在NCBI網(wǎng)站上進行nBlast并分析。

表1 半定量RT-PCR中基因名稱、引物序列、PCR程序及擴增片段長度

2 結(jié)果與分析

2.1扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子cDNA的克隆與測序 將提取的扁穗冰草總RNA反轉(zhuǎn)錄后,用設計的引物進行RT-PCR擴增，3個擴增片段大小與預期大小一致(圖1)。因此，初步認定是扁穗冰草中的目的基因片段，將其分別命名為ACcbf,ACdreb,ACmyb,擴增產(chǎn)物經(jīng)過回收，連接轉(zhuǎn)化并克隆測序。序列分別為548,862,319 bp, 測序結(jié)果如圖2所示。將這3個序列上傳GenBank，登錄號分別為：JF957078，JF957079，JF957080。3個基因片段在NCBI 網(wǎng)站上的nBlast結(jié)果表明，各基因片段的序列與相應同源基因序列的相似度基本都能達到90%以上(表2)，因此，認為得到的序列是目的基因。

圖1 目的基因片段擴增瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 扁穗冰草中ACcbf,ACdreb,ACmyb基因序列

2.2不同冷脅迫程度下扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子表達的半定量RT-PCR分析 不同冷脅迫程度下各基因的半定量RT-PCR結(jié)果表明(圖3)，ACcbf基因隨冷脅迫程度的增強表達量增加，恢復到室溫后，表達量開始降低。ACdreb與ACcbf基因的表達趨勢基本一致，這說明兩者對低溫脅迫能夠產(chǎn)生響應。而ACmyb基因在脅迫前后表達量變化不大,說明該基因?qū)囟茸兓幻舾小?/p>

2.3不同干旱脅迫程度下扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子表達的半定量RT-PCR分析 不同干旱脅迫程度下各基因的半定量RT-PCR結(jié)果表明(圖4)，ACcbf 基因在脅迫前未表達，脅迫后表達量增加，而在復水1 d后，表達量降低，說明該基因?qū)Ω珊得{迫能產(chǎn)生響應。但由于整體表達量較低，認為該基因?qū)τ诟珊抵挥幸欢ǔ潭鹊捻憫?，不敏感。ACdreb基因在脅迫后表達量增加，復水1 d后，表達量降低，說明該基因是受到干旱脅迫調(diào)控的。而ACmyb基因出現(xiàn)了和前兩個基因一樣的趨勢，復水后仍然比對照組中表達量高，推測該基因是一種干旱應答轉(zhuǎn)錄因子基因，并且其表達有一定的延續(xù)性。

綜合低溫和干旱兩種脅迫下的結(jié)果，認為ACcbf基因是一種低溫敏感基因，同時對干旱脅迫產(chǎn)生一定的響應，但不明顯。ACdreb基因是一種對低溫和干旱脅迫都能夠產(chǎn)生應答的基因，推測這是該基因?qū)Ω珊岛秃涠寄軐е碌闹参锩撍a(chǎn)生的響應。ACmyb基因?qū)Ω珊得{迫能產(chǎn)生響應，對低溫脅迫不敏感。

表2 ACcbf，ACdreb，ACmyb與其他植物中同源基因的相似度

圖3 不同冷脅迫程度下扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子半定量RT-PCR

圖4 不同干旱脅迫程度下扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子半定量RT-PCR

3 討論

本研究首次在扁穗冰草中克隆出3個不同的轉(zhuǎn)錄因子基因片段并對這3個基因在冷脅迫和干旱脅迫下的表達進行研究，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)各基因的表達與逆境脅迫程度成正相關(guān)，這與已報道的研究結(jié)論基本一致[20-23]。由于各種逆境之間的交叉效應對于研究的影響和植物抗逆信號轉(zhuǎn)導的復雜性，不能簡單地判斷某一基因?qū)τ谔囟婢趁{迫能產(chǎn)生特異的響應。例如，干旱、寒冷、鹽堿都能導致植物脫水，因此，在冷脅迫及干旱脅迫下出現(xiàn)同樣的表達趨勢是正常的。這為試驗結(jié)果的分析帶來了難度。為了進一步研究該基因的表達調(diào)控模式，下一步還須通過RACE技術(shù)克隆這3個基因的全長序列，尋找其CDS并進行轉(zhuǎn)基因等功能研究，以明確其表達調(diào)控模式。

目前對轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控表達的研究主要側(cè)重于對單一逆境條件的調(diào)控, 對其在不同信號途徑相互作用過程中的調(diào)控機制還沒有深入的研究。在轉(zhuǎn)基因試驗中也出現(xiàn)了很多大田研究和實驗室研究不吻合的結(jié)果[24]。因此，欲將轉(zhuǎn)錄因子應用于作物的轉(zhuǎn)基因或者遺傳育種，對于這類基因表達過程的信號轉(zhuǎn)導以及轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控還需要進一步的研究。本研究對扁穗冰草中的轉(zhuǎn)錄因子進行了初步探索，為設計相應的核酸探針、深入分析這類基因的轉(zhuǎn)錄及表達機制進而應用于作物遺傳育種提供參考。

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