柴 娜,張 穎,王景安

(天津市細(xì)胞遺傳與分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300387)

甘草(Glycyrrhiza uralensis)具有耐旱、耐鹽[1]、耐沙埋等特性,固沙能力強(qiáng),是維護(hù)我國(guó)西部荒漠、半荒漠草原地區(qū)生態(tài)環(huán)境的重要植物[2]。其根莖可入藥,具有補(bǔ)脾益氣、止咳祛痰、清熱解毒、調(diào)和諸藥的功能,素有“十藥九草”之美稱。主治脾胃虛弱,倦怠乏力,咳嗽痰多,癰腫瘡毒,緩解藥物毒性、烈性[3]。其莖葉富含營(yíng)養(yǎng)成分,可作為優(yōu)質(zhì)牧草應(yīng)用于畜牧業(yè)[4]。此外,甘草還廣泛應(yīng)用于食品、日用化工等領(lǐng)域[5]。隨著甘草應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,甘草和甘草制品的需求量呈猛增趨勢(shì),野生甘草資源日益減少,供求矛盾十分突出,通過人工栽培甘草來(lái)滿足市場(chǎng)需求已成為最佳選擇,但目前缺乏優(yōu)良的栽培品種,嚴(yán)重制約著栽培甘草的質(zhì)與量。從現(xiàn)有野生群落或栽培群體中篩選藥材質(zhì)量?jī)?yōu)良的變異類型,培育成優(yōu)良品種的方法是最為快速有效的途徑[6]。本研究以天津師范大學(xué)試驗(yàn)地種植的四年生烏拉爾甘草為材料,對(duì)不同基因型甘草的產(chǎn)量、藥用成分含量及可溶性糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等成分含量進(jìn)行分析,以期篩選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的類型,并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 以天津師范大學(xué)試驗(yàn)地烏拉爾甘草為試驗(yàn)材料,種子購(gòu)自北京時(shí)珍中草藥技術(shù)(集團(tuán))有限公司。

試驗(yàn)地材料按植株莖表皮顏色分為紫紅植株、綠色植株;按植株高度分為高大植株(株高大于150 cm)、低矮植株(株高小于120 cm)。從中選取9株,編號(hào),截取根莖繁育成株系,選擇生長(zhǎng)狀況接近的幼苗移入Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng),每一株系栽種10棵,每5 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液,培養(yǎng)50 d后測(cè)定分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物量相關(guān)數(shù)據(jù)的測(cè)定 測(cè)定不同基因型甘草的株高、地上部分鮮質(zhì)量及根鮮質(zhì)量。殺青并烘干至質(zhì)量不變后測(cè)定其地上部分干質(zhì)量及根干質(zhì)量。分別將根、葉粉碎,過60目篩,保存于干燥器內(nèi)備用。

1.2.2 甘草酸含量的HPLC測(cè)定 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm ×4.6 mm,5 μ m)。以乙腈為流動(dòng)相A,0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B,按中國(guó)藥典[7]中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)樣量為10 μ L,柱溫 30 ℃,流速 1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。

以體積分?jǐn)?shù)0.5%氨水與體積分?jǐn)?shù)10%乙醇的溶液為提取劑[8],參照文獻(xiàn)[9]方法提取甘草酸。按上述HPLC條件測(cè)定不同供試樣品溶液峰面積,并根據(jù)與對(duì)照峰面積的比值計(jì)算其甘草酸含量。

1.2.3 甘草黃酮、甘草多糖含量的測(cè)定 采用超聲法[10]提取甘草黃酮。提取液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的KOH顯色后測(cè)定其吸收值[11]。根據(jù)回歸方程,計(jì)算樣品的黃酮含量。

按1∶30固液比加入蒸餾水,超聲提取甘草多糖[12-13]。采用苯酚-硫酸顯色法[14]測(cè)定不同樣品甘草多糖含量。

1.2.4 可溶性糖、淀粉含量的測(cè)定 可溶性糖及淀粉提取及測(cè)定方法參見文獻(xiàn)[15]。

1.2.5 氨基酸含量的測(cè)定 測(cè)定可溶性糖的提取液,也可用作游離氨基酸的測(cè)定[16],測(cè)定方法為茚三酮顯色分光光度法[17]。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用直接提取法[18]提取蛋白質(zhì),加入100 mg/L考馬斯亮藍(lán)G-250溶液顯色后測(cè)定[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 所有測(cè)定均重復(fù)3次。利用Excel 2003軟件處理基礎(chǔ)數(shù)據(jù),用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同基因型甘草生物量的比較 不同基因型部分甘草株高和地上干質(zhì)量均存在顯著差異(表1)。8號(hào)植株株高近70 cm,顯著高于矮類植株(P＜0.05),其地上部分干質(zhì)量亦顯著高于其他植株(P＜0.05);2號(hào)植株最矮小,株高僅31 cm,其地上部分干質(zhì)量亦最低。根作為甘草的藥用部分,其產(chǎn)量高低尤為重要。7號(hào)和8號(hào)植株根產(chǎn)量在0.2 g以上,而其他植株根產(chǎn)量都未達(dá)到0.2 g/株,有的甚至低于0.1 g/株。地上部分生長(zhǎng)旺盛者,利于植株的光合與干物質(zhì)積累,因此根產(chǎn)量亦高。從可見的表觀性狀與產(chǎn)量的關(guān)系來(lái)看,高大綠莖植株的根產(chǎn)量高于矮小紫莖植株,但它們的根含水量沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.2 不同基因型甘草藥用成分含量比較 不同基因型甘草中甘草酸、甘草黃酮、甘草多糖含量均有顯著差異(表2)。甘草酸含量變化在0.118%～0.295%,其中,4號(hào)植株甘草酸含量顯著高于其他植株(P＜0.05);8號(hào)和3號(hào)植株的甘草黃酮含量均在0.3%以上,顯著高于除9號(hào)以外的其他植株(P＜0.05),含量最低者僅0.189%;甘草多糖含量變化較大,在0.448%～2.907%,最低者不足最高者的1/6。以甘草酸含量為主,綜合考慮甘草黃酮及多糖含量,2號(hào)、4號(hào)和8號(hào)為3個(gè)品質(zhì)優(yōu)良的植株,而5號(hào)和7號(hào)植株3種藥用成分含量均很低,品質(zhì)較差。不難發(fā)現(xiàn),甘草品質(zhì)的優(yōu)劣與莖稈顏色及植株高矮沒有必然的聯(lián)系。

表1 不同基因型甘草株高、干質(zhì)量及含水量比較

表2 不同基因型甘草甘草酸等藥用成分含量比較%

從每株的甘草酸產(chǎn)量來(lái)看,8號(hào)植株最高,為0.450 mg/株 ,1 號(hào)植株最低 ,僅 0.141 mg/株,不足前者的1/3?？梢?8號(hào)植株是甘草酸含量高(即品質(zhì)好)且產(chǎn)量高的優(yōu)良植株。另外,7號(hào)植株的甘草酸含量相對(duì)偏低,但其產(chǎn)量最高,計(jì)算得甘草酸的單株產(chǎn)量為0.315 mg,僅次于8號(hào)植株,亦屬較高類型。由此可見,要從現(xiàn)有野生群落或栽培群體中篩選優(yōu)良植株,不僅要考慮其品質(zhì),產(chǎn)量也是一個(gè)重要因素。只有甘草酸含量和植株產(chǎn)量都達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn),如本研究篩選出的8號(hào)植株,才是生產(chǎn)上需要的優(yōu)質(zhì)類型。

2.3 不同基因型甘草糖類物質(zhì)含量比較 不同基因型甘草根可溶性糖含量見表3。4號(hào)植株含量顯著高于其他植株(P＜0.05),為18.336%,植株合成糖的能力強(qiáng),其甘草酸含量最高但產(chǎn)量低,可能的原因是糖類高效地向次生物質(zhì)轉(zhuǎn)化,而向構(gòu)建植物體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化相對(duì)較少。9號(hào)植株可溶性糖含量為16.034%,也屬較高類型,但與4號(hào)植株相反,其甘草酸含量不高但產(chǎn)量高,糖類高效的向構(gòu)建植物體的物質(zhì)轉(zhuǎn)化,向次生物質(zhì)轉(zhuǎn)化較少。5號(hào)植株根可溶性糖含量顯著低于其他植株(P＜0.05),僅4%,3號(hào)和8號(hào)植株的含量在7%左右,也屬于較低類型。在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氮等的供給水平相同的條件下,不同基因型甘草通過光合作用合成糖的能力不同,糖類經(jīng)過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)的能力也不同。糖含量低,可能是自身合成糖的能力差,也可能是植株體內(nèi)糖類向其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化的多。5號(hào)植株品質(zhì)差,產(chǎn)量也不高,究其根源是5號(hào)植株合成可溶性糖的能力本身就差,向其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)化自然就少,3號(hào)植株亦是如此;而8號(hào)植株合成糖類的能力較強(qiáng),糖類向構(gòu)建植物體的物質(zhì)和向次生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率高,所以植株的品質(zhì)好產(chǎn)量也高。3號(hào)植株根淀粉含量較2號(hào)植株高,但與其他植株相比沒有顯著差異,說(shuō)明不同基因型甘草淀粉儲(chǔ)存量與其產(chǎn)量和品質(zhì)沒有密切關(guān)系。

部分基因型甘草葉中可溶性糖、淀粉含量差異達(dá)到顯著水平(表3)。觀察發(fā)現(xiàn),葉中可溶性糖和淀粉含量隨甘草產(chǎn)量的增加而降低,說(shuō)明高產(chǎn)類型具有高效的將糖類向構(gòu)建植物體物質(zhì)轉(zhuǎn)化的特點(diǎn),這可能是高產(chǎn)的主要原因。

表3 不同基因型甘草可溶性糖和淀粉含量比較 %

2.4 不同基因型甘草蛋白質(zhì)及氨基酸含量比較 不同基因型甘草根中蛋白質(zhì)含量見表4。5號(hào)和1號(hào)植株的含量在5 mg/g以上,顯著高于其他植株(P＜0.05),2號(hào)植株的含量顯著低于其他植株(P＜0.05),為3.839 mg/g。優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的8號(hào)植株蛋白質(zhì)含量為4.365 mg/g,屬居中類型,表明此株系在保持生長(zhǎng)和積累有效藥物成分方面達(dá)到了較好的平衡。根中氨基酸含量變化在16.678～34.223 mg/g,8號(hào)植株氨基酸含量為26.678 mg/g,屬中間類型,表明此株系將糖轉(zhuǎn)化為氨基酸及氨基酸合成蛋白質(zhì)協(xié)調(diào)性很好,保證了它具有較高的產(chǎn)量。

除4號(hào)植株含量顯著高于其他外,不同基因型甘草葉中氨基酸含量差異不顯著(P＞0.05)。而由氨基酸合成的蛋白質(zhì)含量在葉中有顯著差異(P＜0.05)。其中1號(hào)和4號(hào)植株的蛋白質(zhì)含量顯著高于其他植株,均在7 mg/g以上,6號(hào)植株的蛋白質(zhì)含量顯著低于其他植株,為5.066 mg/g(表4)。

值得注意的是,2號(hào)植株根中氨基酸含量很高,但合成的蛋白質(zhì)的量卻最少,其葉中氨基酸及蛋白含量也體現(xiàn)同樣的趨勢(shì)。說(shuō)明該基因型甘草由氨基酸向蛋白的轉(zhuǎn)化過程緩慢,此過程緩慢必然導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受抑,故植株矮小。雖然2號(hào)植株矮小,但其甘草酸含量并不低,因其生長(zhǎng)速度慢,其積累的次生代謝物質(zhì)多,體現(xiàn)了濃縮效應(yīng)。

表4 不同基因型甘草蛋白質(zhì)和氨基酸含量比較 mg/g

3 討論與結(jié)論

甘草在Hoagland溶液培養(yǎng)條件下,生長(zhǎng)情況與大田基本一致,所以完全可用溶液培養(yǎng)的方法研究大田的情況。

甘草酸、甘草黃酮類、甘草多糖類化合物是甘草的主要藥用成分,其含量是判斷甘草質(zhì)量的重要指標(biāo)。牛小宇等[19]的研究表明,相同環(huán)境下甘草酸含量變異很大,與本研究得到的結(jié)果相同。楊全等[20-21]的研究表明,在甘草形態(tài)變異類型中,綠莖莖光滑類型甘草的甘草酸、總黃酮含量顯著高于其他形態(tài)變異類型,紫紅莖莖光滑類型、紫紅莖基莖光滑類型多糖含量最高。但本研究發(fā)現(xiàn),藥用成分含量高的植株,并沒有集中于某一基因型,甘草品質(zhì)的優(yōu)劣與植株高矮及莖表皮顏色沒有必然的聯(lián)系。

本研究從初生代謝物質(zhì)與甘草酸等次生代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和相互關(guān)系的角度探討優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)甘草形成的機(jī)理。認(rèn)為只有合成糖的能力強(qiáng),并將糖高效、協(xié)調(diào)的轉(zhuǎn)化為構(gòu)建植物體的物質(zhì)和次生代謝物質(zhì),才能得到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的植株,也只有品質(zhì)和產(chǎn)量都達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn),才是生產(chǎn)上需要的優(yōu)質(zhì)類型。

本研究選出的品質(zhì)好產(chǎn)量高的株系(8號(hào)),其產(chǎn)量達(dá)到了最低產(chǎn)量株系的近3倍,甘草酸含量是含量最低者的1.6倍,可以作為優(yōu)良品種進(jìn)行選育。將其經(jīng)快繁大面積栽培,可明顯提高甘草產(chǎn)量和質(zhì)量,有效緩解我國(guó)甘草資源短缺狀況,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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