高小燕 何守志

許多脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病,如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)和中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變等,都可以導(dǎo)致脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的形成,引起不可逆性中心視力損害。近來(lái),人們做了很多關(guān)于CNV的臨床和實(shí)驗(yàn)研究,尚未發(fā)現(xiàn)明確的治療方法。目前主要的治療方法有激光光凝、玻璃體切割、放射治療等,但這些方法不可避免地具有潛在的損害健康組織的危險(xiǎn)[1]。曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)是一種合成的皮質(zhì)類固醇類藥物,它的主要藥理作用是抗炎和免疫抑制。TA和其他的類固醇藥物是已知的在動(dòng)物模型中能有效抑制新生血管生成的藥物[2]。本實(shí)驗(yàn)主要研究玻璃體內(nèi)注射 TA抑制CNV形成和發(fā)展的作用和機(jī)制,為臨床治療CNV提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備和主要藥品試劑 氪激光機(jī)(美國(guó)Coherent公司,型號(hào)Novua 2000);FFA攝像機(jī)(德國(guó)Heideberg公司);Image-ProPlus 5.1圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)。40 g·L-1TA注射液(昆明積大制藥有限公司);兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體、即用型SABC試劑盒、復(fù)合消化液6 mL、ICAM-1原位雜交檢測(cè)試劑盒、0.01 mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司);AEC顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BN大鼠CNV模型的建立 36只健康雄性棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),系清潔級(jí)動(dòng)物,體質(zhì)量 200～220 g。隨機(jī)分為 TA組和對(duì)照組,每組 18只,隨機(jī)選取一眼進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。5 g·L-1復(fù)方托品酰胺眼液滴雙眼散瞳,左下腹腔內(nèi)注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3.0 mL·kg-1)麻醉,檢查雙眼前節(jié)和眼底均正常。滴 10 g·L-1甲基纖維素后,參照趙世紅等[3]的方法建立CNV動(dòng)物模型,TA組大鼠眼前放置-53 D接觸鏡,氪激光(647 nm)圍繞視盤等距離光凝視網(wǎng)膜20點(diǎn)。激光參數(shù):功率360 mW,光斑直徑100 μm,曝光時(shí)間0.05 s。

1.2.2 藥物應(yīng)用 光凝后即刻在全身麻醉狀態(tài)下,用10 g·L-1丁卡因滴眼液行表面麻醉,手術(shù)顯微鏡下,30 G針頭顳側(cè)角膜緣后0.5mm作一穿刺口,微量注射器從穿刺口進(jìn)針,深度約為 1.5 mm,針尖朝向視神經(jīng)方向,玻璃體中可見針尖,緩緩注入TA 8 μL,由散大的瞳孔可觀察到玻璃體中 TA的白色混懸液,輕輕拔針后,顯微鑷子輕夾穿刺口片刻,以利于穿刺口閉合。對(duì)照組 BN大鼠玻璃體內(nèi)注射同等容量的等滲BSS液。因注射造成晶狀體損傷眼均排除實(shí)驗(yàn)。每組光凝后 1周、2周、4周各選擇 6只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 FFA檢查 在視網(wǎng)膜光凝后2周、4周,各選取 6只大鼠進(jìn)行麻醉、散瞳,腹腔內(nèi)注射 100 g· L-1熒光素鈉0.3 m L,行FFA檢查。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取6張F(tuán)FA圖像,進(jìn)行IOD值計(jì)算,取其平均值。

1.2.4 病理標(biāo)本的制作 FFA檢查后,分別在光凝后 1周、2周、4周時(shí),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)深度麻醉下各摘除6只BN大鼠的眼球,用DEPC處理過(guò)的蒸餾水沖洗,置于40 g·L-1多聚甲醛+0.1 mol·L-1PBSDEPC液中固定2 h。梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋,蠟塊4℃保存?zhèn)溆?。眼球組織 5μm厚度連續(xù)切片,置于50℃DEPC處理過(guò)的蒸餾水中展片,撈片,置烤箱37℃烤片12 h后,4℃保存,備用做 HE染色,400倍光鏡下觀察細(xì)胞浸潤(rùn)情況及 CNV生長(zhǎng)情況,測(cè)量CNV面積,免疫組織化學(xué)檢測(cè)ICAM-1的蛋白表達(dá)情況及原位雜交檢測(cè)ICAM-1mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。

1.2.5 ICAM-1蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫孵育 10 min,阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,蒸餾水沖洗,0.01 mol·L-1PBS液浸泡5min;切片置于含0.01 mol· L-1枸櫞酸鹽緩沖液的抗原修復(fù)盒中,置于微波爐中微波中火加熱15 min進(jìn)行抗原熱修復(fù),滴加一抗兔抗大鼠ICAM-1(體積比為1∶70),4℃過(guò)夜,0.01 mol·L-1PBS液洗滌;滴加生物素化山羊抗兔IgG (二抗),37℃孵育20 min,0.01 mol·L-1PBS液洗滌;滴加SABC,37℃孵育20 min,0.01 mol·L-1PBS液洗滌;滴加AEC,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間為3～10 m in,蒸餾水充分洗滌;蘇木素輕度襯染10 s,自來(lái)水充分水洗,水溶性封片劑封片。0.01 mol·L-1PBS液取代一抗孵育,作為陰性對(duì)照,試劑盒中已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。切片內(nèi)被染成紅色的點(diǎn)、團(tuán)簇為陽(yáng)性反應(yīng)物。400倍光鏡下,選取每個(gè)眼球連續(xù)切片中含有最大CNV直徑的切片,對(duì)每張切片的ICAM-1蛋白表達(dá)的免疫著色I(xiàn)OD值進(jìn)行測(cè)量,取5張切片的平均IOD值作為每個(gè)標(biāo)本的觀察值。

1.2.6 ICAM-1 m RNA的原位雜交檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至DEPC-H2O;體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫孵育10 min,滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水洗3次;根據(jù)試劑盒說(shuō)明暴露mRNA片段、后固定、預(yù)雜交、雜交:滴加含ICAM-1寡核苷酸標(biāo)記探針的雜交液20μL,原位雜交專用蓋玻片蓋在玻片上,置于濕盒中 42℃雜交18 h;滴加封閉液37℃反應(yīng)30 min;滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃孵育1 h;滴加SABC 37℃孵育30min;生物素化過(guò)氧化物酶37℃孵育20m in;AEC室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,蒸餾水洗滌;蘇木素復(fù)染20 s,充分水洗,GVA水溶性封片劑封片。切片中呈團(tuán)簇、點(diǎn)狀的紅色著色為陽(yáng)性。用不含探針的雜交液進(jìn)行雜交作為陰性對(duì)照,試劑盒中已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。400倍光鏡下,選取每個(gè)眼球連續(xù)切片中含有最大CNV直徑的切片,對(duì)每張切片的ICAM-1mRNA陽(yáng)性著色的IOD值進(jìn)行測(cè)量,取5張切片的平均IOD值作為每個(gè)標(biāo)本的觀察值。

1.3 圖像分析與數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)對(duì)ICAM-1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性著色、ICAM-1mRNA的陽(yáng)性著色、CNV的面積、FFA檢測(cè)的IOD值進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)資料以s表示,不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)差異的顯著性用單因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較用SNK檢驗(yàn),同一時(shí)間的組間比較用Student t檢驗(yàn),以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光凝后4周內(nèi)CNV情況 光凝后4周內(nèi),TA組病理組織切片可見纖維血管膜增殖(fibrovascular proliferation,FVP)形成不明顯,光凝處視網(wǎng)膜外層斷裂,視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細(xì)胞和Bruch膜缺失,少量紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在激光斑處,視網(wǎng)膜被拉向缺失區(qū),在RPE細(xì)胞和Bruch膜的缺失處可見到明顯的鞏膜,CNV形成不明顯。對(duì)照組可見清晰的FVP形成,CNV隨時(shí)間增長(zhǎng)而增厚,CNV中包含膠原組織和管腔中含有紅細(xì)胞的增殖血管,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較TA組明顯,主要是巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖1)。光凝后4周內(nèi)CNV面積變化見表1。TA組CNV面積隨時(shí)間增長(zhǎng)呈增加趨勢(shì),與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05)。

Figure 1 Situation of CNV at 4weeks after photocoagulation(HE,× 400).A:Unobvious formation of CNV in TA group;B:CNV became thicker in control group 光凝后4周,CNV情況(HE,×400)。A:TA組CNV形成不明顯;B:對(duì)照組可見明顯CNV形成

2.2 FFA檢查 光凝后4周內(nèi)FFA檢查結(jié)果見表1。光凝后 4周時(shí),TA組熒光滲漏較 2周時(shí)增加,其IOD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TA組滲漏邊界較清,熒光強(qiáng)度低,其IOD值與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。

表1 CNV面積和FFA檢查結(jié)果在4周內(nèi)的變化Tab le 1 Change of CNV area and FFA(IOD)in 4 weeks after photocoagulation (s,n=6)

表1 CNV面積和FFA檢查結(jié)果在4周內(nèi)的變化Tab le 1 Change of CNV area and FFA(IOD)in 4 weeks after photocoagulation (s,n=6)

Note:Comparedwith the former time pointin the samegroup,*P＜0.05;Compared with the control group at the same time,△P＜0.05

1 week 1 896.30±323.54△ 3 244.28±592.35 - -2 weeks 2 178.39±802.87*△4 485.99±487.77*241.52±33.88△ 542.55±33.99 4 weeks 3 233.16±632.81*△6 231.01±226.25*310.27±39.83*△712.59±39.64*

2.3 光凝后4周內(nèi)ICAM-1 m RNA和ICAM-1蛋白的表達(dá) 光凝后4周內(nèi)ICAM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄和ICAM-1蛋白的表達(dá)見表 2。光凝后4周內(nèi),TA組ICAM-1mRNA的轉(zhuǎn)錄隨CNV生長(zhǎng)略有增加,但組內(nèi)IOD值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);ICAM-1 mRNA在TA組中的轉(zhuǎn)錄遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組,同一時(shí)間點(diǎn)2組間IOD值相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。TA組可見光凝處視網(wǎng)膜外層斷裂,RPE細(xì)胞層斷裂,細(xì)胞排列紊亂,FVP不明顯,表現(xiàn)為微量的ICAM-1mRNA表達(dá);對(duì)照組ICAM-1mRNA表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖2)。

ICAM-1免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,在 4周內(nèi),TA組ICAM-1蛋白表達(dá)隨CNV生長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)(均為P＜0.05),但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同時(shí)期的對(duì)照組(均為P＜0.05,圖3)。

表2 ICAM-1 mRNA和ICAM-1蛋白的IOD值在4周內(nèi)的表達(dá)Table 2 Change of IOD value of ICAM-1 mRNA and protein in 4 weeks after photocoagulation (s,n=6)

表2 ICAM-1 mRNA和ICAM-1蛋白的IOD值在4周內(nèi)的表達(dá)Table 2 Change of IOD value of ICAM-1 mRNA and protein in 4 weeks after photocoagulation (s,n=6)

Note:Compared with the former time point in the samegroup,*P＜0.05;Compared with the controlgroup at the same time,△P＜0.05

Time IOD valueof ICAM-1m RNA IOD value of ICAM-1 protein TA group Control group TA group Control group 1week 5.49±1.59△ 8.52±1.09 6.46±2.75△ 15.53±3.02 2weeks 7.04±1.70△ 20.36±1.82* 13.39±4.18*△ 44.91±5.02* 4weeks 7.66±0.48△ 48.49±2.05* 35.47±7.62*△ 123.29±7.77*

Figure 2 Weakly positive expression of ICAM-1 mRNA in TA group(A)at 4weeksafter photocoagulation;Strongly positive expression in control group(B)(HE,×400) 光凝后4周,ICAM-1 mRNA在TA組(A)中弱陽(yáng)性表達(dá);在對(duì)照組(B)中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(HE,×400)

Figure 3 Protein expression of ICAM-1 protein at 4 weeks after photocoagulation(HE,×400).A:Weakly positive expression in TA group;B:Strongly positive expression in control group 光凝后4周,ICAM-1蛋白表達(dá)(HE,×400)。A:TA組呈弱陽(yáng)性表達(dá);B:對(duì)照組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)

3 討論

CNV是許多脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的最終結(jié)局,可導(dǎo)致不可逆性的中心視力損害,是一個(gè)較難治療的疾病,大部分是和AMD、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變相關(guān),目前的治療方法均為 CNV形成后的對(duì)癥治療。治療CNV的關(guān)鍵在于阻斷其發(fā)展過(guò)程,而藥物治療是最有希望阻斷病變發(fā)展進(jìn)程的方法,早期使用抗血管生成藥物來(lái)控制CNV的發(fā)生、發(fā)展逐漸受到重視,如應(yīng)用皮質(zhì)類固醇[2]等。TA為合成的皮質(zhì)類固醇類藥物,又稱丙酮氟羥潑尼松龍、丙酮去炎松或去炎松 A等,為不溶于水的白色或類白色結(jié)晶狀粉末,臨床常用其醋酸酯,注射劑為微細(xì)顆粒的混懸液。

本實(shí)驗(yàn)采用玻璃體內(nèi)注射 TA的方法觀察其對(duì)BN大鼠CNV的治療效果。注射藥物在手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行,避免因注射造成晶狀體損傷。藥物在大鼠玻璃體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)未知,據(jù)大鼠的簡(jiǎn)化眼模型可知玻璃體的平均容積為 56μL[4],故玻璃體內(nèi)注射40 g·L-1TA 8μL,最終的藥物濃度為5.7 g· L-1,比在臨床中用在人眼中的濃度(1 g·L-1)高5倍多,避免了實(shí)驗(yàn)中藥物用量不足,且該劑量相對(duì)于大鼠的玻璃體容積是可以施行的。對(duì)照組注射同等容量的等滲BSS液,避免了由穿刺操作造成的物理影響,或者是由液體注入造成的眼壓改變導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果改變,保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

本實(shí)驗(yàn)采用BN大鼠光凝后即刻玻璃體內(nèi)注射TA,光凝后2周和4周分別行FFA檢查,結(jié)果顯示TA組在4周時(shí)熒光滲漏較2周時(shí)增加,其IOD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但其 IOD值增加不能排除與激光斑萎縮引起濃厚的組織著染有關(guān);且光凝后2周、4周時(shí)IOD值較對(duì)照組明顯降低,顯示CNV的形成和生長(zhǎng)明顯受到抑制。光鏡下觀察,光凝后 1周、2周和4周時(shí)TA組CNV面積略增加,但明顯低于同時(shí)期的對(duì)照組,證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)光凝后即刻玻璃體內(nèi)注射TA 8μL能顯著抑制新生血管形成和發(fā)展。這與Ciulla等[2]的結(jié)論一致,他們認(rèn)為TA可能是通過(guò)抑制白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放血管形成因子而發(fā)揮抑制CNV的作用。

TA治療CNV的機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)及原位雜交的方法,發(fā)現(xiàn)光凝后 4周內(nèi)ICAM-1mRNA及其蛋白的表達(dá)隨CNV生長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng);TA可以降低BN大鼠激光斑損傷區(qū)中的ICAM-1mRNA和ICAM-1蛋白的表達(dá),從而抑制激光斑損傷處的炎癥反應(yīng),達(dá)到治療效果。說(shuō)明該細(xì)胞因子可能通過(guò)多種不同的機(jī)制參與CNV的生長(zhǎng)。很久以來(lái),皮質(zhì)類固醇激素就被認(rèn)為具有抗血管生成特性,它通過(guò)改變細(xì)胞外基質(zhì)的降解和抑制白細(xì)胞釋放血管生長(zhǎng)因子而發(fā)揮作用。以往也有研究證實(shí)TA可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)的更新[2]和 RPE細(xì)胞反應(yīng),包括增加血-視網(wǎng)膜屏障的功能和下調(diào)VEGF基因的表達(dá)[5]。Penfold等[5]發(fā)現(xiàn)玻璃體內(nèi)注射TA可影響ICAM-1表達(dá),下調(diào)炎癥標(biāo)記物。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子如VEGF、ICAM-1和MCP-1等的表達(dá),可防止眼內(nèi)新生血管形成和炎癥反應(yīng)[6]。亦有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在小鼠的CNV組織中ICAM-1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性[7],而在PDT治療后人眼的 CNV膜上的ICAM-1表達(dá)隨治療次數(shù)增加而下降[8]。我們發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜光凝后即刻玻璃體內(nèi)注射TA可以顯著降低ICAM-1mRNA轉(zhuǎn)錄和ICAM-1蛋白的表達(dá),CNV面積明顯減小。皮質(zhì)類固醇的一個(gè)重要作用即抗炎,炎癥是參與CNV形成的重要發(fā)病機(jī)制[9-10],因此,TA可能通過(guò)抗炎作用在CNV中發(fā)揮有效的治療作用。

近來(lái),人們?cè)谂R床上已采取單獨(dú)使用TA玻璃體內(nèi)注射或?qū)⑵渥鰹槠渌煼ǖ妮o助療法治療CNV,取得了一定療效[9,11-12]。此外,有臨床資料表明 TA治療CNV除抑制新生血管的生長(zhǎng)外,還能夠改善視力[5,13],為其治療 CNV的可行性提供了科學(xué)根據(jù)。但是不容忽視的是 TA玻璃體內(nèi)注射產(chǎn)生的一些并發(fā)癥,一是由注射過(guò)程中操作不慎所致,如感染、玻璃體內(nèi)出血等;二是由藥物本身可能的毒性作用引起,如眼壓升高[13]、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜脫離及視網(wǎng)膜毒性反應(yīng)等。TA的給藥劑量、適應(yīng)證、藥劑劑型、是否需要重復(fù)給藥、遠(yuǎn)期效果及并發(fā)癥等仍需進(jìn)一步研究證實(shí),其生物學(xué)效應(yīng)仍需進(jìn)行更為深入的研究。

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