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        培哚普利及高糖對(duì)RF/6A細(xì)胞SOCS3表達(dá)的影響△

        2011-03-12 07:20:28李倩鄭志顧青許迅
        眼科新進(jìn)展 2011年3期
        關(guān)鍵詞:培哚高糖孵育

        李倩 鄭志 顧青 許迅

        糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是一種嚴(yán)重的致盲性眼病,是多種細(xì)胞因子參與的以視網(wǎng)膜血管滲漏和新生血管形成等為特征的最常見(jiàn)的一種糖尿病慢性并發(fā)癥,其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確,目前仍缺乏對(duì)其有效的干預(yù)手段。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)[1],血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)培哚普利對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜具有明顯的保護(hù)作用,且這種作用獨(dú)立于其抗高血壓作用,但是其作用機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。

        細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)是Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)通路的一種重要的負(fù)反饋性調(diào)節(jié)因子,多種細(xì)胞因子都能誘導(dǎo)其生成,通過(guò)對(duì)JAK2/STAT3通路的直接或間接阻斷作用[2],可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子引起的先天性和獲得性免疫、胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡等過(guò)程。已有研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜中也有 SOCS3的表達(dá)[3]。但是,目前關(guān)于SOCS3這一重要負(fù)調(diào)控因子在糖尿病視網(wǎng)膜中的作用及調(diào)控機(jī)制等研究較少。本研究采用高濃度葡萄糖刺激猴視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A,觀察對(duì)SOCS3表達(dá)的影響,并采用JAK2的抑制劑AG490及活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)高糖的這一作用,以了解高糖對(duì)SOCS3作用的機(jī)制。同時(shí),利用培哚普利對(duì)RF/6A細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),進(jìn)一步探索培哚普利對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜保護(hù)作用的機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料 猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A)株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;甘露醇、培哚普利、AG490、N-乙酰半胱氨酸(NAC)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;兔抗SOCS3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;β-actin小鼠單抗、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG均購(gòu)自北京四正柏生物公司;ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。SYBRGreen Real-time PCR Master Mix購(gòu)自日本TOYOBO公司,熒光定量PCR儀IQ5型購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 RF/6A細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清、100×106U·L-1青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基使細(xì)胞同步化24 h后,各組加入干預(yù)藥物。

        分組:第一組高糖干預(yù):每皿細(xì)胞加入高糖DMEM培養(yǎng)基(含葡萄糖25 mmol·L-1)后,37℃培養(yǎng)一定的時(shí)間(0 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h),取細(xì)胞進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

        第二組藥物干預(yù):正常對(duì)照組(NG組,普通DMEM培養(yǎng)基,含5 mmol·L-1葡萄糖);甘露醇組(NG+M組,NG+20 mmol·L-1甘露醇組);高糖組(HG組,高糖DMEM培養(yǎng)基,含葡萄糖25 mmol· L-1);培哚普利對(duì)照組(NG+P組,NG+10 μmol· L-1培哚普利組);高糖+培哚普利干預(yù)組(HG+P組,HG+10 μmol·L-1培哚普利組);N-乙酰半胱氨酸(NAC)高糖干預(yù)組(HG+NAC組,HG+10 mmol· L-1NAC組);AG490高糖干預(yù)組(HG+AG490組,HG+10 μmol·L-1AG490組)。各組加入干預(yù)藥物后,37℃培養(yǎng)24 h。

        1.2.2 Western blotting檢測(cè)RF/6A細(xì)胞中SOCS3蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞藥物干預(yù)完成后,吸除培養(yǎng)液,預(yù)冷PBS洗2次后,加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液100 μL,冰浴振蕩30 min。用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到離心管中,于4℃、12 000 r·min-1離心15 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中,即為提取的總蛋白。用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取等量蛋白質(zhì)樣本,與上樣緩沖液混合后煮沸5 min后置于冰上,進(jìn)行十二烷基磺酸鈉丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE),轉(zhuǎn)膜,50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉1 h,一抗為兔抗SOCS3(1∶1 000),4℃過(guò)夜,TBST洗10 min×3次,加入 HRP標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(1∶3 000)二抗室溫孵育2 h,TBST洗10 min×3次,暗室中ECL發(fā)光液覆蓋膜,X線膠片曝光,顯影,定影。將PVDF膜置于蛋白洗脫液中15 min后取出,一抗改為β-actin小鼠單抗(1∶2 500),二抗為HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000),其余步驟同上。掃描儀掃描底片進(jìn)行半定量分析。

        1.2.3 RT-PCR檢測(cè)RF/6A細(xì)胞中SOCS3 mRNA的表達(dá) 采用Trizol一步法提取RF/6A細(xì)胞中總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈(PCR)擴(kuò)增,總反應(yīng)體系為30 μL。使用軟件Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物,上海生工生物工程有限公司合成。SOCS3:上游引物:5’-AAGCTGGTGCACCACTACATGC-3’,下游引物:5’-CGGTCTTCCGACAGAGATGC-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物226 bp;β-actin:上游引物:5’-AGAGGCATTCTCACCCTGAAG-3’,下游引物:5’-AAGGTCTCAAACATGATCTGGGT-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物197 bp。反應(yīng)條件: 94℃ 20 s,58℃ 20 s,72℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)PCR獲得的溶解曲線和擴(kuò)增曲線分析結(jié)果的可靠性并設(shè)定閾值,輸出Ct值。采用比較2-△△Ct值的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。運(yùn)用ANOVA進(jìn)行多組間變量分析比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 高糖孵育不同時(shí)間對(duì)SOCS3蛋白表達(dá)的影響

        高糖分別孵育0 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h后RF/ 6A細(xì)胞中SOCS3表達(dá)的Western blotting的結(jié)果及各組相對(duì)含量的比較見(jiàn)圖1。SOCS3正常情況下在RF/6A細(xì)胞內(nèi)呈低水平表達(dá),與2 h、4 h、8 h、24 h高糖干預(yù)后的結(jié)果比較,差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001),在高糖孵育2 h后即發(fā)現(xiàn)明顯上調(diào)(P<0.001),且上調(diào)幅度隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加明顯,至高糖孵育24 h時(shí)的表達(dá)量與2 h相比,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而SOCS3蛋白的表達(dá)在高糖孵育48 h后顯著減少至接近正常水平,與0 h培養(yǎng)結(jié)果比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        2.2 藥物干預(yù)對(duì)SOCS3蛋白表達(dá)的影響 各組干預(yù)的RF/6A細(xì)胞中SOCS3表達(dá)的Western blotting的結(jié)果及相對(duì)含量的比較見(jiàn)圖2。正常對(duì)照組和甘露醇組的SOCS3蛋白的表達(dá)量相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高糖可誘導(dǎo)SOCS3蛋白表達(dá)顯著增加,與正常對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);ROS抑制劑NAC作用后,可抑制高糖對(duì)SOCS3蛋白的誘導(dǎo)作用,與高糖組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。JAK2的抑制劑AG490也可使高糖作用下的SOCS3蛋白表達(dá)降低,與高糖組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        培哚普利能誘導(dǎo)SOCS3蛋白表達(dá)增加。培哚普利對(duì)照組(NG+P)、高糖+培哚普利干預(yù)組(HG+ P)分別與正常對(duì)照組比較,SOCS3蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)(均為P<0.001);與高糖組比較,差異也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。高糖聯(lián)合培哚普利干預(yù)組與培哚普利對(duì)照組相比,可顯著上調(diào)SOCS3蛋白的表達(dá)(P<0.001)。

        2.3 藥物干預(yù)對(duì)SOCS3 mRNA的影響 各個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的 cDNA產(chǎn)物,經(jīng) Real-Time PCR擴(kuò)增后,SOCS3及β-actin反應(yīng)管均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,溶解曲線為單一峰。表明提取細(xì)胞RNA質(zhì)量及RTPCR反應(yīng)過(guò)程良好,無(wú)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。正常對(duì)照組、高糖組、高糖+培哚普利干預(yù)組、AG490高糖干預(yù)組的2-△△Ct值分別為1.00、2.69±0.18、7.87± 0.26、1.87±0.13。24 h高糖培養(yǎng),可誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞SOCS3的mRNA水平較正常對(duì)照組增高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高糖聯(lián)合培哚普利的刺激后,對(duì)SOCS3 mRNA的誘導(dǎo)上調(diào)作用更加顯著,與高糖組相比,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。AG490干預(yù)后可抑制SOCS3 mRNA表達(dá)的增加,與高糖組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

        Figure 2 Western blotting analysis of SOCS3 protein expression in RF/6A cells cultured in NG group,NG+M group,HG group,NG+P group,HG+P group,HG+AG490 group,HG+NAC group,respectively.Compared with NG group,*P<0.001;Compared with HG group,△P<0.05,#P<0.001 NG組、NG+M組、HG組、HG+P組、NG+P組、HG+AG490組、HG+NAC組的RF/6A細(xì)胞中SOCS3蛋白表達(dá)的Western blotting結(jié)果及相對(duì)表達(dá)量的比較。與NG組比較,*P<0.001;與HG組相比,△P<0.05、#P<0.001

        Figure 3 RT-PCR analysis of SOCS3 mRNA in RF/6A cells cultured in NG group,HG group,NG+P group,HG+P group.Compared with NG group,**P<0.01;Compared with HG group,△P<0.05,#P<0.001 NG組、HG組、NG+P組、NG+P組的RF/6A細(xì)胞中 SOCS3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較。與 NG組相比,**P<0.01;與HG組相比,△P<0.05、#P<0.001

        3 討論

        SOCS3是SOCS家族的成員之一,其結(jié)構(gòu)包含有中央SH2區(qū),長(zhǎng)度和序列可變的N區(qū)(氨基端)和一段約40個(gè)氨基酸大小的保守序列——SOCS盒(羧基端)[4]。SOCS3在視網(wǎng)膜的全層都有表達(dá),但基礎(chǔ)表達(dá)水平極低[3]。先前的研究已證實(shí)糖尿病狀態(tài)可致SOCS3表達(dá)升高[5]。JAK/STAT通路是一條快速的從細(xì)胞外到細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),高糖可誘導(dǎo)牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加,JAK2/STAT3信號(hào)通路激活,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)上調(diào),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6],導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管的形成[7]。作為JAK2/STAT3信號(hào)途徑的重要負(fù)調(diào)控因子,過(guò)表達(dá)的SOCS3可明顯抑制高糖刺激的JAK/STAT通路及其下游的炎癥因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等激活引起的組織損傷。本研究采用脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象,進(jìn)一步探討高糖對(duì)SOCS3表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOCS3蛋白的表達(dá)在高糖孵育后2 h已增加,且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而上調(diào),至孵育48h后降低至正常水平。這與Ortiz-Munoz等[8]的研究結(jié)果一致。

        高糖是如何刺激SOCS3的表達(dá)增高呢?我們采用ROS的清除劑NAC對(duì)高糖作用下的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)SOCS3的表達(dá)水平明顯降低,說(shuō)明ROS可能位于SOCS3上游,高糖狀態(tài)下ROS的生成增加可刺激SOCS3表達(dá)上調(diào)。我們還發(fā)現(xiàn),JAK2的抑制劑AG490也可以防止高糖誘導(dǎo)的SOCS3表達(dá)上調(diào)。我們以前的研究已發(fā)現(xiàn)ROS可引起高糖誘導(dǎo)的牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞JAK2/STAT3活化[9-10],因此,我們推測(cè)高糖誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞早期SOCS3上調(diào)可能與ROS/JAK2/STAT3通路活化有關(guān)。增加的SOCS3在細(xì)胞中發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,以抑制JAK2/STAT3通路的過(guò)度活化,防止炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活。

        ACEI作為一線的抗高血壓藥物,目前的研究證實(shí)它也是一種外源性新生血管抑制劑,對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜組織有保護(hù)作用。如卡托普利可顯著減輕DR早期周細(xì)胞的腫脹與丟失[11]。在體內(nèi)卡托普利可顯著改善背景型DR血-視網(wǎng)膜屏障的功能,減少白蛋白的滲漏[12]。本課題組既往的研究發(fā)現(xiàn),培哚普利通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的線粒體ROS生成,既可下調(diào)VEGF,又可上調(diào)色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF),顯著降低高糖誘導(dǎo)的VEGF/PEDF的比值增加,同時(shí)可緩解糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管組織損傷,具體表現(xiàn)為周細(xì)胞凋亡、無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管生成的減少及視網(wǎng)膜血管基底膜增厚的減輕[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),卡托普利的干預(yù)可以顯著抑制JAK2/STAT3的激活[13]。我們應(yīng)用高糖聯(lián)合培哚普利對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示培哚普利聯(lián)合或不聯(lián)合高糖均可刺激SOCS3的表達(dá)增加,說(shuō)明培哚普利有直接上調(diào)RF/6A細(xì)胞SOCS3表達(dá)的作用。綜合上述的分析,培哚普利的這種作用可能是通過(guò)對(duì)ROS/JAK2/STAT3通路的抑制而獲得的。

        總之,本研究首次發(fā)現(xiàn),高糖及ACEI類藥物培哚普利可顯著上調(diào)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中SOCS3表達(dá);培哚普利的這一作用可能與其對(duì)ROS/ JAK2/STAT3通路的抑制有關(guān)。

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