李林強(qiáng),田萬強(qiáng),昝林森

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710062;2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程系,陜西 楊凌 712100;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

牛瘦素受體基因表達(dá)及其結(jié)合瘦素特性研究

李林強(qiáng)1,田萬強(qiáng)2,3,昝林森＊3

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710062;2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程系,陜西 楊凌 712100;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

[目的]以秦川牛為研究對象,克隆、原核表達(dá)秦川牛瘦素受體(Lepr)基因的蛋白功能區(qū),分析表達(dá)蛋白對瘦素結(jié)合特性,為研究瘦素受體與瘦素結(jié)合的調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。[方法]本研究通過RT-PCR法從秦川牛肉m RNA擴(kuò)增獲得Lepr IG基因的cDNA序列,克隆至p MD18-T載體獲得重組質(zhì)粒,并進(jìn)行序列測定。將測序正確的cDNA序列定向克隆到p ET 30a(NdeI/XhoI),構(gòu)建表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌,IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE分析,鎳柱親和層析法分離純化融合蛋白,高效液相色譜—迎頭法分析重組表達(dá)蛋白對廋素結(jié)合功能。[結(jié)果]表明秦川牛Lepr IG基因在大腸桿菌中獲得高效表達(dá);Lepr IG融合蛋白以可溶性和包涵體2種形式表達(dá);高效液相色譜—迎頭分析法進(jìn)一步表明重組表達(dá)蛋白具有結(jié)合瘦素的功能。[結(jié)論]秦川牛Lepr IG基因在大腸桿菌中獲得高效表達(dá),表達(dá)蛋白具有結(jié)合瘦素的功能,為通過調(diào)節(jié)瘦素受體對瘦素結(jié)合,抑制能量代謝,促進(jìn)秦川牛脂肪沉積奠定了基礎(chǔ)。

牛;瘦素受體;IG 基因;克隆;表達(dá)

Leptin具有參與調(diào)節(jié)攝食、能量代謝等功能,通過其受體(Leptin receptor,Lepr)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此,瘦素受體在調(diào)節(jié)體脂平衡和能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用。Tartaglia等(1995)首先發(fā)現(xiàn)存在于小鼠脈絡(luò)叢內(nèi)的leptin受體(OB-R),并測得小鼠的OB-R m RNA呈單個帶狀,長度約 5.1 kb[1]。OB-R是一種跨膜受體,由細(xì)胞外的配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)三部分組成[2]。小鼠的OB-R由894個氨基酸殘基組成,人的OB-R由1165個氨基酸殘基組成。在小鼠中 Leptin受體存在OB-Ra、OBRb、OB-Rc、OB-Rd和OB-Re 5種異形體(isoform),其中只有OB-Rb屬于長受體,具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,為功能受體,其它的均為短受體。長受體與短受體的胞外長度一致,它們之間的差異在于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的長度不同。這些異形體的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中頭29個氨基酸序列完全相同[3]。OB-Rb的胞內(nèi)區(qū)含有2個結(jié)構(gòu)域,一個可以激活Janus激酶(Just another kinase或Janus kinase,JAK),另一個可以和轉(zhuǎn)錄蛋白的激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)相互作用,借以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄,OB-Rb是唯一能進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)熱量攝入和能量消耗的異形體[4]。目前研究最多的是OBRa,其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由33個氨基酸組成,它不能激活JAK激酶,也不能激活STA Ts。因此,它不具有信號傳遞功能,它可能作為Leptin的結(jié)合蛋白,調(diào)節(jié)游離的 Leptin濃度或作為 Leptin轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,使Leptin經(jīng)過血腦屏障到達(dá)其作用位點(diǎn)[4,5]。OB-Re是唯一的可溶性受體,其功能是作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,OB2Rc和OB2Rd的功能目前尚不清楚。

目前,對瘦素、瘦素受體基因及其功能的研究主要集中于人和小鼠,主要是為了研究人類肥胖疾病產(chǎn)生的機(jī)理、預(yù)防和治療方法,對黃牛OB-R研究尚處初級階段,本文以中國五大黃牛之一的秦川牛為研究對象,克隆表達(dá)OB-R基因的蛋白結(jié)合區(qū),為調(diào)控OB-R與Leptin的結(jié)合,抑制牛能量代謝,促進(jìn)牛肌間脂肪沉積提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 PCR擴(kuò)增目的片段

采用T rizol法提取秦川牛肌肉組織基因組m RN A,DNA酶處理后,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測核糖體RNA 28S和18S帶的完整性(紫外分光光度計測定波長260 nm和280 nm處的OD值1.8～2.0)。用Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Life Science)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。RT-PCR獲得目標(biāo)基因,引物序列見表1。RT-PCR條件:95℃3 min,1個循環(huán);94℃20 s;55℃20 s;72℃1 min 40 s,35個循環(huán);72℃10min,1個循環(huán)。

表1 RT-PCR引物

1.2 克隆載體的構(gòu)建

回收純化 PCR產(chǎn)物,將獲得的 1728 bp的Lepr基因cDNA序列連接 T-Vector(pMD18-T載體),4℃連接過夜,熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑12個克隆進(jìn)行PCR,然后進(jìn)行質(zhì)粒抽提,酶切鑒定插入片段。

表 2 p ET 30a酶切體系

表3 Lepr基因和p ET 30a(Nde1/Xho1)連接體系

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建以及在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)

將陽性克隆及表達(dá)載體pET 30a質(zhì)粒經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切(酶切體系見表2)后,回收1728 bp的片段以及載體大片段,將目的片段和載體大片段連接(連接體系見表3)過夜后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。菌液PCR初步鑒定正確后,提取質(zhì)粒,用NdeI和XhoI鑒定正確后測序。挑取測序正確的單克隆于5 mL含100m g/L氨芐的 LB液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng) 12～14 h。次日,按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)至OD值為0.6時,加IPTG至終濃度為1 mmol/L,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h,同時將空載體p ET 30a的誘導(dǎo)表達(dá)作陰性對照。在不同的時間點(diǎn)收集菌液,以10000 r/min速度離心10min沉淀菌體,加入SDS蛋白上樣緩沖液混勻后,煮沸10min,離心取上清10μL進(jìn)行SDS-PAGE。

1.4 目標(biāo)蛋白親和純化(His-tag親和柱)

利用His-tag親和柱進(jìn)行目的蛋白的純化。

1.5 Lepr蛋白與Leptin結(jié)合作用高效液相色譜—迎頭分析法(high performance liquid chromatography-frontal analysis,HPLC-FA)

高效液相色譜一迎頭分析法(HPLC-FA)是基于凝膠過濾迎頭分析法的原理發(fā)展起來的色譜方法,適宜高親和勢的蛋白結(jié)合作用的分析,樣品可不經(jīng)任何處理直接進(jìn)樣分析,通過柱切換和手性色譜柱相連,可進(jìn)行蛋白結(jié)合作用的立體選擇性研究。

色譜條件:日本分光公司JascoUV-975紫外可見分光光度檢測器;色譜柱為Pinkerton GFF II-S5-80內(nèi)表面反相(IS RP)柱,150mm×4.6 mm ID,5 μm(Regis Chemical Company,Illinois,USA);流動相為67 mmol·L-1磷酸鹽等滲緩沖液(p H 7.4,I=0.17 mol·L-1);流速0.2 m L·min-1;紫外檢測波長290 nm;進(jìn)樣量900μL;柱溫37℃。

樣品溶液的配制:吸取500μL Leptin(0.1 ng/μg)溶液于容量瓶中,然后加入等體積的Lepr蛋白溶液(0.12 mg/mL),加入5 mL等滲磷酸鹽緩沖液,搖勻,37℃溫育1 h。以Leptin和Lepr蛋白溶液為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR克隆秦川牛Lepr產(chǎn)物電泳檢測

RTμPCR克隆秦川牛Lepr產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果見圖1。由圖1可見所獲目的基因在1750 bp附近,與預(yù)測結(jié)果一致。由圖2可見測序結(jié)果與NCBI原序列比較同源性達(dá)99.77%。

圖1 RT-PCR克隆秦川牛Lepr產(chǎn)物電泳檢測

2.2 酶切鑒定插入片段鑒定

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,選擇白色菌落進(jìn)行PCR,提取陽性菌落質(zhì)粒用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定,結(jié)果見圖 2。結(jié)果表明 Lepr基因插入pMD18-T克隆載體。

圖2 牛Lepr原核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 表達(dá)檢測及高表達(dá)菌株篩選

將轉(zhuǎn)化 pMD18-T和p ET 30a的BL-21(DE3)陽性克隆菌液在37℃、1 mM IPTG誘導(dǎo)3 h后收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果見圖3。由圖3可見克隆得到了約66 k D的預(yù)期蛋白特異帶,與理論估計的相對分子質(zhì)量相符。表明菌株誘導(dǎo)后都有明顯的目標(biāo)蛋白Lepr表達(dá)(箭頭標(biāo)記處)。

圖3 表達(dá)檢測及高表達(dá)菌株篩選

2.4 目標(biāo)蛋白親和純化(His-tag親和柱)

將菌體懸浮于PBS溶液中反復(fù)凍融3次,每克菌體加入80μL 10mg/L的溶菌酶及 40μL 100 nml/LPMSF(蛋白酶抑制劑)混勻,4℃放置30min后超聲波破碎菌體,然后4℃8000×g離心15 min,分別收集上清和沉淀(沉淀主要為包涵體)進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果表明融合蛋白在上清中表達(dá),也以包涵體的形式表達(dá),不過上清中的表達(dá)量要大于包涵體,即融合蛋白可溶性表達(dá)大于包涵體表達(dá)(圖4)。結(jié)果表明通過His親和柱的分步純化,可以從破菌上清中獲得純度合格目標(biāo)蛋白Lepr(泳道F,箭頭標(biāo)記處)。

圖4 目標(biāo)蛋白親和純化

2.5 Lepr蛋白與Leptin結(jié)合作用HPLC-FA分析

Lepr蛋白與Leptin 37℃溫育1 h經(jīng)過HPLCFA,結(jié)果表明產(chǎn)生了新物質(zhì)。結(jié)果提示Lepr蛋白與Leptin發(fā)生了一定程度的結(jié)合,進(jìn)一步表明克隆表達(dá)的Lepr的蛋白結(jié)合區(qū)具有結(jié)合Leptin的功能。

3 討論

Kielar等(1998)報道在下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、側(cè)部及弓狀核存在有豐富的Leptin受體,在其它部位,如心 、胎盤 、肝 、腎 、胰 、脾 、肌肉 、胸腺 、前列腺 、睪丸 、卵巢、小腸、結(jié)腸、腎上腺中均有表達(dá),但水平較低[6],與本文 Lepr組織表達(dá)特性研究結(jié)果基本相同。Houseknecht等(1996)報道,分泌到血液中的Leptin大部分通過與血清蛋白結(jié)合來運(yùn)輸,而后與下丘腦的Leptin受體結(jié)合,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[7,8]。Wabitsch等(1996)也認(rèn)為leptin與位于下丘腦及脂肪組織的Lepr結(jié)合,會產(chǎn)生抑制食欲、減少能量攝取、增加能量消耗、抑制脂肪合成的作用[9]。表明Lepr功能區(qū)表達(dá)重組蛋白與血清中l(wèi)eptin可能結(jié)合,進(jìn)而可能抑制leptin與位于下丘腦Lepr的結(jié)合。

大理石花紋是評價牛肉品質(zhì)的兩個主要指標(biāo)(大理石花紋和嫩度)之一。肌內(nèi)脂肪組織比較豐富的牛肉在視覺上呈現(xiàn)大理石花紋狀[10,11],而大理石花紋是日本[12,13],美國[14],韓國[15,16],中國等國牛肉品質(zhì)分級的主要指標(biāo)。因此,提高牛肉肌內(nèi)脂肪含量,增加大理石花紋豐富度是肉牛生產(chǎn)研究的熱點(diǎn)。本文克隆和表達(dá)Lepr蛋白結(jié)合區(qū),結(jié)果表明該段基因可進(jìn)行表達(dá)。通過HPLC-FA分析表達(dá)蛋白對Leptin的結(jié)合特性,結(jié)果表明Lepr功能區(qū)表達(dá)重組蛋白與 Leptin發(fā)生了一定程度的結(jié)合。這就為Lepr功能區(qū)表達(dá)重組蛋白對下丘腦Lepr與Leptin結(jié)合產(chǎn)生競爭性抑制,從而抑制牛能量代謝,促進(jìn)牛肌內(nèi)脂肪的沉積,以及為抑制牛能量代謝微生態(tài)制劑的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。當(dāng)然,攝食和能量代謝的調(diào)節(jié)是多種神經(jīng)遞質(zhì)在下丘腦互作的結(jié)果,因此,要闡明Lepr蛋白結(jié)合區(qū)對牛肌內(nèi)脂肪調(diào)節(jié)機(jī)理還有許多要解決的問題。

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Studies on Protein Expression of Functional Region of Leptin Receptor Gene and its Character of Combinding Leptin in Cattle

LI Lin-qiang1,TIAN Wan-qiang2,3,ZAN Lin-sen＊3

(1.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi'an,Shaanxi 710062,China;2.Department of Animal Engineering,Yang ling Vocational&Technical College,Yangling,Shaan xi 712100,China;3 College of Animal Science and Tech no logy,North west A&F Universit,Yang ling,S haan xi 712100,China)

【Objective】In this paper,the functional region of leptin receptor IG gene was cloned and ex-pressed,the expressed protein combining leptin properties were analyzed,which would provide theoretical basis for the regulation of Lepr and leptin combinding.【Method】T he cDNA of Lepr IG gene was amplified from muscle m RNA of Qinchuan cattle by RT-PCR.The PCR product was cloned into the T vector pMD18-T to construct plasmid for sequencing.Then the cDNA was subcloned into the prokaryotic expressing plasmid vector pET 30a(NdeI/Xho1)and transformed into host Escherichia coli strain BL2l(DE3)for expression.The expression of Lepr function protein was induced by IPTG,and was identified by SDSPAGE.The protein was purified by Ni NTA column.Combinding leptin function of the expressed recombinant protein via high performance liquid chromatography frontal analysis(HPLC-FA).【Result】The results showed that Lepr IG gene was highly expressed in Escherichia coli,and the expression product was observed with soluble protein and inclusion body,the expressed recombinant protein had the function of combinding leptin.【Conclusion】In vitro expressed exogenous,Lepr IG gene protein had combinding leptin function and the study provided the foundation for inhibitting Qinchuan cattle energy metabolism and fat deposition through regulation of Lepr on combinding leptin.

Cattle;leptin Receptor;IG gene;Cloning;Expression

S823.2

A

1001-9111(2011)04-0001-05

2011-03-15

2011-04-22

陜西省13115科技創(chuàng)新工程(No.2010ZDGC-01),教育部長江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展支持計劃(No.IRt 0940)。

李林強(qiáng)(1971-),男,陜西扶風(fēng)人,博士,研究方向為畜產(chǎn)品加工、動物資源開發(fā)與利用。

＊通訊作者:昝林森(1963-),男,陜西扶風(fēng)人,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向為肉牛、奶牛遺傳改良與生長發(fā)育調(diào)控。