陳強(qiáng) 高芬

高原肺動(dòng)脈高壓（high altitude pulmonary hypertension,HAPH）是指生活在海拔2500m以上地區(qū)的人群，因?qū)Ω咴h(huán)境適應(yīng)不全所致低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）及相關(guān)臨床表現(xiàn)[1]。目前認(rèn)為HPH的形成主要與低氧性肺血管收縮（hypoxic pulmonary vasoconstricyion,HPV）和肺血管重建(pulmonary vascular remodeling, PVR)有關(guān)。有研究提示，在大鼠肺動(dòng)脈高壓模型中，血管重建與凋亡密切相關(guān)[2-3]。我們通過測(cè)定高原肺動(dòng)脈高壓大鼠、重返平原大鼠及對(duì)照組大鼠的肺組織caspase-3表達(dá)，探討重返平原對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠80只，體重180～220g,由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑 caspase-3兔抗大鼠IgG(美國abcam公司)；過氧辣根山羊抗兔IgG(北京中杉金橋)；ECL顯色液（美國Pierce公司）;Marker（美國Fermentas公司）；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 研究對(duì)象與分組

將80 大鼠隨機(jī)分為高原組（10、20、30d）、重返平原組（10、20、30、90d）、正常對(duì)照組，每組10只。所有大鼠用相同食物喂養(yǎng),將高原組與重返平原組置于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)中心低壓氧艙內(nèi),模仿海拔5000m高原低氧環(huán)境,進(jìn)行22h/d低氧處理。于10、20和30d各取10只測(cè)定肺血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較，確定是否造模成功。30d后將高原低氧肺動(dòng)脈高壓大鼠帶到海拔580m的陜西省咸陽市繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.3.2 肺組織取材及保存

0.5%烏拉坦腹腔注射麻醉后經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死，無菌迅速取出心肺組織，用生理鹽水沖洗干凈。沿肺門將心肺組織分離，并迅速將肺組織剪成直徑約5mm的小塊放入液氮速凍，然后放入凍存管，轉(zhuǎn)移至－80°冰箱保存。

1.3.3 Western blotting

（1）取肺組織約100mg，剪碎，加入0.5ml蛋白裂解液，手動(dòng)勻漿至無組織塊殘留。(2)4℃離心，12000rpm，1min，取上清冰上孵育5min。(3)4℃離心，5000rpm，10min。取上清，即為蛋白提取液。(4)以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，用BCA法測(cè)蛋白濃度。(5)將樣品煮沸5min后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。(6)電轉(zhuǎn)至PVDF膜。（7）轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫下封閉2h，用1:2500的caspase-3單抗（4℃過夜），第II抗體為過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 1:5000,室溫下孵育1h，最后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑顯色，觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 caspase-3蛋白質(zhì)的表達(dá)

免疫印跡結(jié)果表明，高原組大鼠的caspase-3表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組和重返平原后大鼠的caspase-3表達(dá)，結(jié)果見表1和圖1。

表1 各組大鼠caspase-3的表達(dá)（n=10，）

表1 各組大鼠caspase-3的表達(dá)（n=10，）

注：a P＜0.05 vs 對(duì)照組，b P ＜0.05 vs 高原20d，c P＜0.05 vs 高原30d，d P＜0.05 vs 對(duì)照組。

平原組10d 20d 30d 10d 20d 30d 90d 32.01±0.96 13.88±1.344 5.09±0.75a 6.07±0.90 6.89±0.81 10.53±0.43b 13.08±1.10c 22.30±0.43 d對(duì)照組 高原組

圖1 各組大鼠caspase-3的表達(dá)

3 討論

高原性肺動(dòng)脈高壓是指正常人移居高原后由于低壓性缺氧，引起肺小動(dòng)脈功能及器質(zhì)性改變致使肺動(dòng)脈壓力增高。早期高原性肺動(dòng)脈高壓系因急性缺氧引起的肺小動(dòng)脈收縮，長期慢性低氧則引起肺血管重構(gòu),最終發(fā)展為難治性梗阻性肺動(dòng)脈高壓[4]。目前,有關(guān)低氧性肺血管重建發(fā)病機(jī)制的研究重點(diǎn)主要在細(xì)胞的增殖面。雖然肺血管平滑肌細(xì)胞增殖在低氧性肺血管重建中起至關(guān)重要的作用,但血管壁的構(gòu)成是由細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間的平衡所決定的,所以二者之間的平衡失調(diào)更為重要[5]。

天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinases，Caspase）家族是參與肺血管平滑肌凋亡，抑制肺血管重構(gòu)，阻止肺動(dòng)脈高壓形成的凋亡因子。凋亡分子caspase-3，可啟動(dòng)線粒體途徑和死亡受體途徑引起凋亡，是凋亡的最終執(zhí)行者。我們發(fā)現(xiàn)，模擬高原20d后caspase-3的表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯減少（P＜0.05），這與肖雅瓊等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。重返平原20、30d 后caspase-3的表達(dá)較高原20、30d有所恢復(fù)（P＜0.05）,但是與正常組比較其表達(dá)仍低（P＜0.05）。由此可見，重返平原后，肺動(dòng)脈高壓大鼠的凋亡機(jī)制逐步恢復(fù)，但未達(dá)到正常凋亡水平?？梢酝茰y(cè)，常氧常壓可造成低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管平滑肌caspase-3表達(dá)上調(diào)，增加凋亡，可以有效緩解高原低氧性肺動(dòng)脈高壓。其具體作用機(jī)制及臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步的研究。

[1]Ge Ri-Li,Peter Hackett.Life on the Qinghai-Tibetan plateau[M].Beijing: Peking University Medical Press,2007:100-110.

[2]Cho A, Court man DW,Langille BL.Apotosis(programmed cell death)in arteries of the neonatal lamb[J].Circ Res, 1995, 76: 168-175.

[3]Tuder RM, Marecki JC, Richter A, et al.Pathology of pulmonaryhypertension[J].Clin Chest Med, 2007,28: 23-42.

[4]張新川，張世界.慢性高原心臟病的的資料分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2008,14（10）：88-89.

[5]鐘曉寧，姚龍.肺血管重建在低氧性肺動(dòng)脈高壓中的作用及其機(jī)制[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2003（4）:246-248.

[6]肖雅瓊，肖詩亮,等.Dichloroacetate與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡關(guān)系的研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào),2007,36（4）:482-484.