高艷麗，房志仲，劉 群，李曉華

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，天津300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，天津300070）

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性、易復(fù)發(fā)的腸道炎性疾病，其病因不明，對(duì)該病的治療主要通過(guò)藥物治療改善癥狀、減少?gòu)?fù)發(fā)。治療IBD的傳統(tǒng)藥物柳氮磺胺吡（sulfasalazine，SASP）臨床證明有嚴(yán)重的副作用，作為其替代品，5-氨基水楊酸（5-ASA）廣泛應(yīng)用于臨床，現(xiàn)已成為治療炎癥性腸病的首選藥物[1]。5-ASA又稱為美沙拉嗪（mesalazine），主要通過(guò)抑制前列腺素的分泌以及白三烯和自由基的產(chǎn)生而達(dá)到抗炎作用[2]。但5-ASA只有以原型到達(dá)結(jié)腸病變部位才能發(fā)揮治療作用[3]，將5-ASA制成pH依賴-時(shí)間控制型結(jié)腸定位緩釋微丸[4]，可保證5-ASA到達(dá)結(jié)腸的藥物有足夠的濃度發(fā)揮其抗炎作用，使藥物在胃腸道上部的吸收減少，而在末段回腸或結(jié)腸釋放較高濃度藥物[5]。本研究是在報(bào)道[4]的基礎(chǔ)上采用高效液相色譜法建立5-ASA制成pH依賴-時(shí)間控制型結(jié)腸定位緩釋微丸體外控制方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 SP8810型高效液相色譜儀（美國(guó)熱電公司）；Spectra 100紫外檢測(cè)器（美國(guó)熱電公司）；Anastar色譜工作站；BP210S型電子天平（感量：0.0001g）。

1.1.2 試藥 5-ASA原料藥（武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司）；5-ASA對(duì)照品（Sigma公司）；5-ASA結(jié)腸定位緩釋膠囊（自制），甲醇（色譜純，天津市彪奇科技發(fā)展有限公司）；其它試劑均為市售分析純；重蒸水自制。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：TIANHE Kromasil C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：取Na2HPO4· 12H2O 7.1g，NaH2PO4·2H2O 6.9g置1000mL量瓶中，加適量蒸餾水溶解，再加入6mL 25%的四丁基氫氧化氨溶液，以蒸餾水稀釋至刻度，混勻得緩沖液[6]。將緩沖液與甲醇分別過(guò)濾，按甲醇-緩沖液（25:75）比例混合，脫氣，作為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：0.7mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 5-ASA高效液相色譜圖

1.2.2 分析方法的確證

1.2.2.1 儲(chǔ)備液的制備：精密稱取5-ASA對(duì)照品約25mg置25mL量瓶中，加入流動(dòng)相適量，超聲使溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濃度為1000μg/mL。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取5-ASA儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL分別置于25mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下各進(jìn)樣20μL測(cè)定峰面積。

1.2.2.3 精密度考察：精密量取儲(chǔ)備液2mL，置于25mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度（濃度為80μg/ mL）。在上述色譜條件下，進(jìn)行重復(fù)6次進(jìn)樣，測(cè)定精密度。

1.2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取儲(chǔ)備液2.5mL，置于50mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度（濃度為50μg/mL），在室溫下分別放于棕色瓶與透明瓶中，分別于0、1、2、3、4、5、6、8、10、12h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，考察穩(wěn)定性。

1.2.2.5 專屬性考察：將處方中輔料用流動(dòng)相溶解，濾過(guò)，在上述色譜條件下進(jìn)樣，觀察結(jié)果。

1.2.2.6 回收率測(cè)定：分別精密稱取5-ASA原料藥200mg、250mg和300mg，分別置于盛有處方量輔料的100mL量瓶中，加適量流動(dòng)相，超聲振蕩30min后，以流動(dòng)相稀釋至刻度。濾過(guò)，分別精密吸取續(xù)濾液1mL置于50mL量瓶中。分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。

1.35 -ASA結(jié)腸定位緩釋膠囊的含量測(cè)定

1.3.1 流動(dòng)相的配制 見(jiàn)1.2.1項(xiàng)下色譜條件。

1.3.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取5-ASA對(duì)照品約25mg置25mL量瓶中，加入流動(dòng)相適量，超聲使溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。取該溶液2.5mL，置50mL量瓶中，用緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.3 供試品溶液的配制 取5-ASA結(jié)腸定位緩釋膠囊20粒，將其中微丸傾出，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于5-ASA 250mg)，置100mL量瓶中，加適量流動(dòng)相超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1mL，置于50mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.4 含量測(cè)定 分別取對(duì)照品與供試品溶液進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以峰面積A對(duì)其濃度C（μg/mL）進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程，A= 3578.3C+4081.3，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。結(jié)果表明：5-ASA在20～120μg/mL范圍內(nèi)，峰面積A與濃度C之間成良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度考察 連續(xù)6次進(jìn)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于2.0%，表明該方法精密度良好，見(jiàn)表1。

表1 精密度測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果，RSD值均小于2%，表明5-ASA溶液在室溫下放置12h時(shí)比較穩(wěn)定，且無(wú)須避光，見(jiàn)表2。

2.4 專屬性考察 由圖2可見(jiàn)，輔料不干擾主藥的測(cè)定，方法的專屬性符合測(cè)定要求。

表2 穩(wěn)定性考察

圖2 輔料干擾試驗(yàn)

2.5 回收率測(cè)定 回收率符合方法學(xué)要求，見(jiàn)表3。

表3 回收率結(jié)果（n=9）

2.6 含量測(cè)定 分別在0、1、2、3和6個(gè)月時(shí)觀察外觀樣品色澤和測(cè)定樣品含量，均無(wú)明顯變化，表明其性質(zhì)很穩(wěn)定，見(jiàn)表4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜柱選擇 曾使用YWG C18柱對(duì)5-ASA進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，5-ASA色譜峰的分離度及重現(xiàn)性較差，使用Kromasil C18柱時(shí)分離度及重現(xiàn)性均能符合分析要求。

3.2 流動(dòng)相選擇 使用甲醇∶水、甲醇：水（H3PO4調(diào)節(jié)pH），5-ASA峰型對(duì)稱性較差，以甲醇緩沖液（25:75)比例混合（緩沖液以四丁基氫氧化氨溶液調(diào)節(jié)pH值），得到很好的對(duì)稱峰型及重現(xiàn)性。

3.3 樣品穩(wěn)定性 5-ASA結(jié)腸定位緩釋膠囊經(jīng)加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，外觀色澤、含量、有關(guān)物及釋放度均未發(fā)生明顯變化。這是由于水分散體包衣成膜性較好，能有效的隔絕空氣、水分、光線等外界干擾，很好的保持藥物穩(wěn)定性。

［1］ 盧作勇.炎癥性腸病治療藥物的研究開發(fā)[J].中國(guó)醫(yī)藥情報(bào)，2004，10(2):24

［2］ 楊濤，周四元，梅其炳.治療炎癥性腸病的5-氨基水楊酸口服制劑概述[J].西北藥學(xué)雜志，2003，18(5):237

［3］ Sharon P,Stenson WF.Metabolism of arachidonic acid in acetic acid colitis in rats similarity to human inflammatory bowel disease [J].Gastroenterology,1985,88(1Pt 1):55

［4］ 劉群，李曉華，楊金榮，等.5-氨基水楊酸pH依賴-時(shí)間控制型結(jié)腸定位微丸的制備與體外釋放研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，14（1）：34

［5］ Friend DR.New oral delivery systems for treatment of inflammatory bowel disease[J].Adv Drug Del Rev,2005,57（2）:247

［6］ 國(guó)家藥典委員會(huì).《中華人民共和國(guó)藥典》(二部)[S].2005版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄74-75