張 旭，楊元金，王京樹，田 甜

（中國長江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所，湖北 宜昌 443100）

在動物腸道的微生態(tài)系統(tǒng)中，微生物之間和微生物與宿主之間存在著復(fù)雜而又相對穩(wěn)定的聯(lián)系，宿主為腸道微生物提供棲息的環(huán)境，而腸道微生物又能提高宿主對有害細(xì)菌侵染的抵抗力。大量研究結(jié)果表明，動物腸道正常微生物區(qū)系在動物營養(yǎng)、健康、免疫等方面發(fā)揮著極為重要的作用[1]，它是由多種微生物構(gòu)成的具有廣泛多樣性和復(fù)雜相互作用的微生態(tài)系統(tǒng)。魚類腸道正常菌群是腸道的重要組成部分，是腸道微生物與宿主以及所處的水環(huán)境之間形成的相互依賴、相互制約的微生態(tài)系，它不僅在魚類營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、免疫反應(yīng)以及器官的發(fā)育等方面具有其他因素不可替代的作用，而且還能對魚類的生長、發(fā)育、生理和病理等方面加以影響[2]。

目前對腸道微生物的研究主要是通過動物糞便或腸壁粘液來研究腸道微生物菌群多樣性，對直接取活鮮腸道研究腸道微生物菌群研究報道較少[3]。史氏鱘隸屬于鱘形目、鱘科，分布于黑龍江水系，是瀕臨滅絕的珍稀魚類。至今未見對史氏鱘腸道微生物的研究報道，為此，選用史氏鱘幼魚腸道為研究材料，通過腸壁內(nèi)容物和直接取鮮活腸道提取腸道微生物群落DNA的效果對比，為鱘魚腸道微生物多樣性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 史氏鱘活魚苗。

1.1.2 試 劑 提取緩沖液：100mM Tris，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH 8.0；TE 緩沖液：10mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0；CTAB/NaCl溶液：在 80 mL H2O中溶解4.1 g NaCl，緩慢加入10 g CTAB，同時加熱并攪拌，定容終體積至100 mL；20%SDS，8 mol/L KAc，50%PEG6000，5 mol/L NaCl，3 mol/L NaAc。以上溶液均用超純水配置，121℃滅菌30 min；This飽和酚；氯仿-異戊醇（24∶1）混合液；溶菌酶 100 mg/mL（-20℃冰箱中預(yù)冷）；70%乙醇（-20℃冰箱中預(yù)冷）；異丙醇（-20℃冰箱中預(yù)冷）。

1.1.3 儀器設(shè)備 離心機(jī)、電泳儀、水浴鍋、制冰機(jī)、冰箱、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 魚腸道樣品的采集 在無菌操作臺上進(jìn)行史氏鱘活魚苗魚樣處理，先用75%酒精擦拭魚體表，用解剖剪沿肛門向上朝前呈弧形剪開。75%酒精擦拭消化道外壁，無菌沖洗液（0.9%滅菌生理鹽水）[4]沖洗數(shù)遍。樣品分為兩組，組1用離心管收集內(nèi)容物；組2把鮮活腸道剪碎液氮研磨后裝入離心管中。將收集的魚腸道樣品放到滅菌處理的2mL離心管中，放在-20℃下備用。

1.2.2 腸道微生物總DNA的提取 取處理的魚腸道樣品0.5 g加0.5 g石英砂和850μL提取buffer，劇烈震蕩，核酸提取儀震蕩30 s；加入50μL溶菌酶（100mg/mL）手動混勻，37℃震蕩溫浴30～60 min；加入 100 μL 20%SDS，手動混勻，65℃，30 min，每隔10 min震蕩1次，12 000 rpm、室溫離心10 min；取上清加0.2倍體積的KAc(8 mol/L)冰浴20min，14 000 rpm、10℃離心 20min；取上清加 0.5倍體積的PEG（20%）、0.1倍體積的NaCl（5 mol/L）混勻，室溫放置30 min，14 000 rpm、20℃離心10 min；棄去上清，加500μL 70%乙醇浸泡10min，吹洗，14 000 rpm、20℃離心10min，洗凈乙醇后，自然干燥10～20min，加入700μLTE溶解；加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1），手劇烈震蕩搖勻，12 000 rpm、室溫離心10 min，再加入等體積的氯仿：異戊醇（24∶1）抽提 1 次，12 000 rpm、室溫離心10min；取水相加 0.1 倍體積的 NaAc（3mol/L）、0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置30 min，14 000 rpm、20℃離心10min；棄去上清，加500μL乙醇浸泡吹洗，14 000 rpm、20℃離心 10 min，吸凈乙醇后，自然干燥10~20min，加入60μL TE溶解沉淀（DNA在70%乙醇中可以無限期保存）；質(zhì)量檢測，測量260、280 nm吸收值（A260/280應(yīng)為1.7~1.9）。以水作為空白對照，取水和產(chǎn)物各5μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR引物為接近全長的細(xì)菌通用引物 8F 和 1492R。Primers8F：5′-AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG-3′；Primers1492R：5′-TACGGHTAC CTTGTTACGACTT-3′。

PCR 反應(yīng)體系：10×Taq buffer 5 μL；dNTP 4 μL；Primer F（10 pmol/μL）2 μL；Primer R（10 pmol/μL）2 μL；模板 1μL（10 ng）；Taq 酶 0.4 μL（2U）；加ddH2O至50μL。

PCR 擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性 5 min；94°C 變性 1 min，55°C 退火 1 min，72°C 延伸 2 min，35 個循環(huán)；72°C延伸10min。取PCR產(chǎn)物5μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道細(xì)菌總DNA檢測結(jié)果

兩組樣品的DNA提取物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1顯示。兩組樣品總DNA在20 kb左右，其中1組DNA條帶較為明顯，2組提取DNA條帶較弱，但從后續(xù)PCR擴(kuò)增結(jié)果來看，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有太大影響，可以用于腸道微生物的分子生物學(xué)分析。

圖1 史式鱘腸道微生物總DNA瓊脂糖電泳結(jié)果（M：λ-EcoT14 Idigest DNAMarker；1~2：Sample）

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果

以提取得到的細(xì)菌總DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖2所示，由細(xì)菌通用引物擴(kuò)增出的各組DNA樣品16S rDNA PCR產(chǎn)物長約1 500 bp，顯示圖譜清晰，擴(kuò)增效果較好。

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果（M：Marker DL2000；1~2：PCR product）

3 討論

傳統(tǒng)研究魚類腸道微生物的方法都局限于從培養(yǎng)基中分離得到微生物，這樣所得到的檢測結(jié)果非常容易受到操作方法的影響，而且還會常常低估腸道菌群的數(shù)量和多樣性，不能全面反映腸道微生物之間及微生物與宿主間的真實(shí)相互關(guān)系[5]，而利用分子技術(shù)研究腸道微生物可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)的微生物技術(shù)的不足。

從上述結(jié)果可以看出，提取樣本的不同對DNA提取的效果影響較大。組1明顯比組2的提取效果要好。而且在操作過程中組2的電泳過程中拖尾現(xiàn)象較易出現(xiàn)，可能是由于蛋白質(zhì)含量太高從而影響了DNA的純度。本提取方法僅一次提取即得到高質(zhì)量的模板DNA，而且此DNA能用于16S rDNA的PCR擴(kuò)增，并得到特異性較好的產(chǎn)物。此外，操作過程中不需要額外的DNA提取試劑盒，提供了一種腸道微生物基因組DNA的簡便高效的提取方法，適合腸道微生物多樣性研究。

[1] 趙燕飛，汪明真，胡迎利.腸道菌群與動物免疫的相關(guān)關(guān)系[J].中國獸藥雜志，2004，38（8）：36-38.

[2] 宋增福，吳天星.魚類正常菌群的研究進(jìn)展 [J].水產(chǎn)科學(xué)，2007，26（8）：273-278.

[3] 汪立平，馬相杰，趙 勇.羅非魚幼魚腸道微生物生物基因組DNA 的提取[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（10）：147-150.

[4] MacDonald N L，Stark JR，Ausin B.Bacterialmicroflora in the gastro-intestinal tract of Dover sole（Solea solea L），with emphasis on the possible role of bacteria in the nutrition of the host[J].Femsmicrobiology Letters，1986，35：107-111.

[5] Austin B.The bacterialmicroflora of fish[J].The Scientific World Journal，2002，2：558-572.