鄧顯文，謝芝勛，謝麗基，謝志勤，劉加波，龐耀珊

（廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001）

禽呼腸孤病毒（ARV）廣泛存在于世界范圍內(nèi)的商品肉雞群中，可感染雞、火雞及一些鳥類[1]，臨床上主要引起雞關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎、吸收障礙綜合癥、矮小綜合癥和呼吸道病等多種疾病，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

ARV的基因組為雙股RNA（dsRNA），由大（L）、中（M）和小（S）三組共 10個節(jié)段基因組成[3]。S組有S1、S2、S3、S4四個基因，其中S1基因編碼的σ3蛋白是外殼蛋白中最小的一種蛋白，攜帶有ARV的特異性中和反應(yīng)的表面抗原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體[4-5]，該蛋白還是一種細(xì)胞吸附的特異性蛋白，能夠特異地吸附到禽類細(xì)胞上[6]。由S2基因編碼的σ2蛋白與σ3蛋白一樣，都是病毒的外殼蛋白之一，擁有367個氨基酸，攜帶有群特異型中和抗原決定簇。σ2通過σ3作用，提高感染細(xì)胞上的能力，并在病毒的致病機(jī)理上起著一定的作用[7]。一些研究者據(jù)此進(jìn)行了不同類型ARV疫苗的探索，包括滅活疫苗、弱毒苗和亞單位疫苗等[8-9]。DNA疫苗是將編碼目的抗原蛋白基因序列的真核質(zhì)粒導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)合成抗原蛋白，表達(dá)出的抗原蛋白經(jīng)MHC I類和II類分子提呈免疫系統(tǒng)，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其抗原表達(dá)可持續(xù)數(shù)月[10-11]。因此，DNA疫苗具備類似自然感染的優(yōu)點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)課題。本研究將ARV S1133毒株和廣西分離株R1的編碼σ2蛋白的基因克隆到pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體，用抽提、純化的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行多點(diǎn)肌肉注射的SPF雞，應(yīng)用PCR檢測pCDNA3.1+-S1133-σ2和 pcDNA-R1-σ2陽性重組質(zhì)粒的存在，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 ARV S1133毒株由美國康州大學(xué)Khan博士惠贈，宿主菌JM109，廣西分離株R1[12]，為本室保存。pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體購自Promega公司。

1.1.2 主要酶與試劑 Taq DNA聚合酶、RT-PCR試劑盒和限制性內(nèi)切酶Eco R I、Xho I購自大連寶生物公司。M λDNA/Eco R I+Hind Marker，低分子量蛋白Marker，T4 DNA連接酶和質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司。羊抗雞IgG和Trizol抽提試劑購自GIBCOL公司。禽呼腸孤病毒陽性血清購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)ARV毒株S1133 S2基因序列[U20642]設(shè)計(jì)合成了一對跨越σ2蛋白基因的特異性引物。上游引物序列為XZ141：5’-GCGAATTCGCGCAAGCCGCAATGGAG-3’；下游引物 序 列 為 XZ142：5’-GCTCGAGTGACCCGGAGGTACCTTA-3’。兩引物的5’端分別含有Eco R I和Xho I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增的目的片段長為1 146 bp。引物由大連寶生物公司合成，用TE Buffer配成適當(dāng)濃度，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ARVσ2蛋白基因的獲取 （1）RNA的提?。簠⒄誈IBCOL公司RNA提取試劑盒操作說明。（2）RT-PCR擴(kuò)增ARVσ2基因：反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，建立如下反轉(zhuǎn)錄體系，總反應(yīng)體積為20μL，RNA 為 2 μL（約 20 μg），4 μL 8 mM MgCl2，2 μL 10×PCR緩沖液，2μL 10 mM dNTP（4種堿基），1 μL RNA抑制劑，1μL隨機(jī)引物，1μL Mulv反轉(zhuǎn)錄酶，用無Rnase水加至總體積為20μL，離心均勻，于 25 ℃ 10min，42℃ 60min，99℃ 5min，4℃結(jié)束cDNA合成，供PCR擴(kuò)增備用。（3）σ2基因的PCR擴(kuò)增：采用100μL反應(yīng)體系，即在20μL cDNA管中加入 4 μL 8 mM MgCl2，8 μL 10×PCR 緩沖液，600 ng上游引物和下游引物，0.5μL（2.5單位）Taq DNA聚合酶，用無菌水加至總體積為100 μL，首先 94℃ 5 min，然后進(jìn)入 94℃ 1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min的循環(huán)，循環(huán)35次后，最后72℃延伸10min結(jié)束，4℃保存。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 用DNA片段回收試劑盒，切膠回收目的片段，經(jīng)Eco R I和Xho I雙酶切，取純化的ARVσ2蛋白基因產(chǎn)物按2∶1的比例與經(jīng)同樣雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）混勻，反應(yīng)體系為 10×buffer 1 μL，PCR 回收產(chǎn)物（200mg/L）2 μL，pCDNA3.1+載體（100mg/L）1 μL，dH2O 6μL。16℃連接過夜（16 h）。吸取10μL連接產(chǎn)物，分別加入到200μL JM109α（CaCl2法制備）的感受態(tài)細(xì)胞中，隨后冰浴30 min，42℃ 1.5 min，冰浴1～2min，加入800μL無Amp的LB培養(yǎng)液于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45min。然后吸100 uL均勻涂布于含有Amp（終濃度為100 mg/L）的LB瓊脂平板上，待液體吸干后37℃預(yù)熱20 min，倒置平板，于37℃培養(yǎng)過夜。挑選呈白色菌落的重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR初步鑒定后，用Eco RⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定的ARV S1133、廣西分離株R1的陽性重組質(zhì)粒命名為 pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2。分別提取陽性菌落的質(zhì)粒DNA測序。

1.2.4 免疫疫苗的制備 （1）pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2：將陽性重組質(zhì)粒劃線于含有Amp的LB瓊脂平板上，挑取單個菌落在含Amp（終濃度為100mg/L）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定OD260值，計(jì)算重組質(zhì)粒DNA 的濃度。（2）σ2蛋白：ARV σ2結(jié)構(gòu)蛋白采用廣西獸醫(yī)研究所已構(gòu)建好的質(zhì)粒菌，參照謝芝勛等[13-14]介紹的方法表達(dá)、鑒定并且純化，加入弗氏佐劑制備而成。（3）ARV滅活苗：由本實(shí)驗(yàn)室滅活A(yù)RV S1133，加入弗氏佐劑制備而成。

1.2.5 免疫保護(hù)試驗(yàn) （1）試驗(yàn)雞分組及免疫接種：試驗(yàn)前隨機(jī)抽取5只SPF雞，剖殺取關(guān)節(jié)、肝、腎、脾、法氏褰、胸腺、腦等7個部位樣品，處理[11]抽提核酸后，參照謝芝勛[12]的方法進(jìn)行RT-PCR檢測。試驗(yàn)設(shè) pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1組、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2 組、滅活苗免疫組、σ2蛋白組及空白對照組。pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫1組、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2組：按 40 μg的劑量免疫14日齡SPF雞（各15只）2次，每次間隔一周，采用多點(diǎn)肌肉注射。滅活苗免疫組：各取0.1mL的ARV滅活苗經(jīng)頸部皮下免疫14日齡SPF雞（15只）2次，每次間隔一周。σ2蛋白免疫組：按100μg的劑量經(jīng)頸部皮下免疫14日齡SPF雞（15只）2次，第一次免疫時加入等量的弗氏完全佐劑，第2次免疫時加入等量的弗氏不完全佐劑?？瞻讓φ战M（15只）：注射0.1mL的生理鹽水。（2）免疫雞血清的 Western-blotting 分析：pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫組及空白對照組免疫前和第2次免疫后2周，采血收集血清，參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行Western-blotting分析。（3）試驗(yàn)雞的RT-PCR檢測 ：pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 組、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2組、滅活苗免疫組、σ2蛋白免疫組及空白對照組第2次免疫后2周，試驗(yàn)雞經(jīng)爪墊攻毒10倍稀釋的ARV S1133株雞胚尿囊液0.1mL。攻毒第3天開始撲殺試驗(yàn)雞，分別在第3、5、7天采集關(guān)節(jié)、肝、腎、脾、胸腺、胰腺、法氏囊等7個部位樣品，應(yīng)用RT-PCR檢測ARV S1133 RNA存在，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，用Excel軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARVσ2基因的RT-PCR擴(kuò)增

用引物XZ141和XZ142進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，S1133、R1擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，由圖1可見ARV S1133毒株和廣西分離株R1擴(kuò)增產(chǎn)物在1 146 bp處均有一條清晰的條帶，與預(yù)期擴(kuò)增目的基因大小相一致，說明引物設(shè)計(jì)合理，RT-PCR反應(yīng)條件正確，成功擴(kuò)增了σ2基因。

2.2 重組質(zhì)粒的PCR、酶切和測序鑒定

用篩選的陽性重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增的目的片段與預(yù)期擴(kuò)增目的基因大小相一致，約為1 146 bp，說明質(zhì)粒初步鑒定為陽性質(zhì)粒。取陽性重組表達(dá)質(zhì)粒DNA進(jìn)行Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到4 968 bp的載體DNA和1146 bp的σ2基因片段（見圖2），說明目的基因已經(jīng)插入到表達(dá)載體中，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，表明插入的片段為σ2目的基因，表達(dá)σ2基因插入的位置，大小和閱碼框架均正確。

2.3 Western-blotting結(jié)果

如圖3所示，pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫1組、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2組二免后收集的血清在71.3 kD左右有一特異條帶，而對照組及pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫組免疫前收集的血清無此特異性反應(yīng)，說明pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 組、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2 組免疫SPF雞后能產(chǎn)生特異性血清。

2.4 免疫效果

用RT-PCR檢測接種前撲殺雞的關(guān)節(jié)、肝、腎、脾、胸腺、胰腺和法氏囊均未檢出ARV RNA。用RT-PCR檢測SPF雞攻毒后的不同組織抽提的ARV RNA，檢測結(jié)果見表1。從表中可看，空白對照組與滅活苗免疫組、pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫1組 、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2組和σ2蛋白免疫組差異均顯著（p<0.05）；σ2蛋白免疫組與 pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 組、pCDNA3.1+-R1-σ2免

表1 SPF雞免疫后人工感染ARV后RT-PCR的檢出率

疫2組差異顯著（p<0.05），其中空白對照組與滅活苗免疫組、pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 組 、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2組和σ2蛋白免疫組差異均極顯著（p<0.01）。σ2蛋白免疫組與pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 組 、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2 組差異不顯著（p>0.05）；pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1組 、與pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2組差異不顯著（p>0.05）。滅活苗免疫組檢出率為 5.7%，pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫1組檢出率為11.4%，pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2組檢出率為 10.5%，σ2蛋白免疫組免疫組檢出率為8.6%，檢出率均明顯低于空白對照組，說明各免疫組的相應(yīng)疫苗都發(fā)揮了免疫保護(hù)作用。在整個試驗(yàn)中，最高檢出部位為關(guān)節(jié)、胸腺、胰腺和法氏囊檢出率比較低。

3 結(jié)論與討論

（1）根據(jù)ARV毒株S1133 S2基因序列[U2064 2]設(shè)計(jì)合成了一對跨越σ2蛋白基因的特異性引物XZ141和XZ142進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增了σ2基因，擴(kuò)增的目的片段長為1 146 bp。回收σ2基因目的片段并克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）中，經(jīng)PCR鑒定和Eco RⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，說明目的基因已經(jīng)插入到表達(dá)載體中，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，表明插入的片段為σ2目的基因的位置，大小和閱碼框架均正確。

（2）pcDNA載體為含有tac啟動子以及Amp抗性基因的真核高效表達(dá)載體，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成目的蛋白抗原，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該蛋白的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)出針對保護(hù)性抗原的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的[15]。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增完整的禽呼腸孤病毒ARVσ2基因，將其插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）中，成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)抽提、純化的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行多點(diǎn)肌肉注射的SPF雞，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)在第7天仍能從注射肌肉部位、肝、關(guān)節(jié)檢出 pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2陽性重組質(zhì)粒，說明了pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2能在雞體內(nèi)存活；用Western-blotting對免疫雞血清分析表明，該陽性重組質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗ARVσ2基因蛋白的抗體。

（3）在被檢測的7種組織中，攻毒后關(guān)節(jié)的ARV RNA的檢出率最高，其次為脾和腎，胸腺、胰腺和法氏囊檢出率比較低，說明攻毒所用的ARV毒株對關(guān)節(jié)具有親嗜性。

（4）本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增完整的禽呼腸孤病毒ARVσ2基因，將其插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）中，成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2。用抽提的pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2重組質(zhì)粒接種SPF雞2次后，以ARV S1133毒株進(jìn)行攻毒，使用RT-PCR方法對免疫雞關(guān)節(jié)及內(nèi)臟器官進(jìn)行檢測，從表1可看出，pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1組檢出率為 11.4%，、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2組檢出率為10.5%明顯低于空白對照組（32.4%）（p<0.05），與滅活苗免疫組比較差異不顯著（p>0.05），說明用構(gòu)建的 pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫SPF雞，雞只獲得了較好的免疫保護(hù)。同時，pcDNA-σ2免疫組的檢出率還稍微高于σ2蛋白免疫組的原因，是否是受重組質(zhì)粒DNA免疫劑量、免疫途徑或者σ2蛋白免疫劑量高的影響，重組質(zhì)粒 pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫雞能否有更好的免疫效果還有待于進(jìn)一步研究。

（5）σ2蛋白是ARV外殼蛋白之一，攜帶有群特異型中和抗原決定簇，與σ2蛋白一樣能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的群特異性抗體，σ2通過σ3作用，提高病毒感染細(xì)胞的能力，在ARV的感染和致病作用上有著重要作用。通過對S1133、R1廣西分離株σ2蛋白基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+），并證明了該重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗σ2基因蛋白的抗體，為進(jìn)一步研究ARV免疫奠定了基礎(chǔ)。

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