陳教文 湯亞玲 劉紅 朱志宇 呂迪 耿寧 陳宇

（口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學(xué)，成都 610041）

姜黃素對口腔舌癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移能力影響的實驗研究

陳教文 湯亞玲 劉紅 朱志宇 呂迪 耿寧 陳宇

（口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學(xué)，成都 610041）

目的 探討姜黃素對口腔舌癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移能力的作用及其作用機(jī)制。方法 分別以0、5、10、20、30、60、100μmol·L-1姜黃素處理人舌癌細(xì)胞SCC-4 24 h，采用MTT法、侵襲實驗、流式細(xì)胞儀、免疫熒光顯微鏡分別檢測姜黃素對口腔舌癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移能力的影響。然后，采用cDNA微陳列芯片技術(shù)篩選和實時定量RTPCR驗證姜黃素所調(diào)控的相關(guān)基因。結(jié)果 MTT法檢測顯示：超過20μmol·L-1濃度時姜黃素明顯地抑制細(xì)胞增殖。侵襲實驗顯示：姜黃素在20、30、60μmol·L-1時對SCC-4癌細(xì)胞的侵襲有明顯抑制作用。流式細(xì)胞儀分析顯示：姜黃素在20、30、60μmol·L-1的劑量下對細(xì)胞周期的分布有顯著的作用，熒光顯微鏡觀察，姜黃素（30μmol·L-1）會造成SCC-4癌細(xì)胞的細(xì)胞支架中的alpha-tubulin產(chǎn)生聚集的現(xiàn)象。cDNA微陳列芯片分析顯示：87個基因可被姜黃素誘導(dǎo)增加；198個基因受姜黃素抑制。結(jié)論 姜黃素抑制口腔舌癌的增殖和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是使cdc27、EGFR substrate 15、PPAR-alpha和H2A histone基因表達(dá)水平降低，從而使細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的M期，達(dá)到抗舌癌細(xì)胞增殖的作用。

舌癌； 姜黃素； 增殖； 轉(zhuǎn)移

舌癌（tongue cancer）是口腔常見的惡性腫瘤之 一[1]，初期癥狀不明顯，大部分患部在診斷時可能已經(jīng)發(fā)生浸潤或轉(zhuǎn)移。因此，疾病的治療和預(yù)后也大受影響。癌癥的治療效果主要取決于腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的能力，而轉(zhuǎn)移能力則是判斷患者愈后的重要指標(biāo)。雖然已研究出許多藥物能夠有效地控制癌細(xì)胞的生長，但至今仍無有效藥物能夠抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。

姜黃素（curcumin）是姜黃（curcuma longa）中最重要的有效主成分之一，傳統(tǒng)上常用其作為食材的矯色以及矯味，近年來也常作為化妝品以及醫(yī)藥上的添加物。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上，姜黃味苦辛，入肝脾，功能理血中之氣，下氣破血，除風(fēng)消腫，力烈于郁金；被認(rèn)為有治氣脹血積，產(chǎn)后敗血攻心，通月經(jīng)，療補損及治風(fēng)寒濕痹?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗氧化（清除自由基）、抗動脈粥樣硬化、抗癌、抗炎及抗血管新生等功能[3-4]，但就其理論及機(jī)制的研究還相當(dāng)缺乏。本研究首先檢測姜黃素是否具有抑制口腔舌癌上皮細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的能力，然后，在姜黃素不會使正常細(xì)胞致死的劑量下，以cDNA微陳列芯片技術(shù)篩選出姜黃素調(diào)控的相關(guān)基因，以探討姜黃素抗癌能力的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要的實驗材料和儀器

姜黃素（Sigma公司，美國）采用高效液相色譜法從姜黃中提取，相對分子質(zhì)量為368.38，分子式為[HOC6H3（OCH3）CH=CHCO]2CH2。用10mmol·L-1DMSO液配置成0、5、10、20、30、60、100μmol·L-1，備用。cDNA微陳列芯片以及人舌癌細(xì)胞SCC-4（中國臺灣國立大學(xué)提供）。

1.2 姜黃素對人舌癌細(xì)胞增殖和侵襲作用的影響

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SCC-4置于DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后每3 d傳代培養(yǎng)。分別用0、5、10、20、30、60、100μmol·L-1的姜黃素處理細(xì)胞24 h，以作下面的檢測。

1.2.2 細(xì)胞存活率檢測 采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。

1.2.3 侵襲實驗 采用Matrigel侵襲實驗檢測經(jīng)過不同劑量姜黃素處理過的SCC-4癌細(xì)胞侵襲能力的差異。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，70%乙醇固定，以碘化丙啶（propidium iodide，PI）染細(xì)胞核，上機(jī)檢測細(xì)胞周期。以細(xì)胞在G0/G1、S和G2/M期的比例來測量細(xì)胞周期。

1.2.5 免疫熒光染色法 先將SCC-4細(xì)胞在載玻片上培養(yǎng)，經(jīng)藥物處理后，70%乙醇和甲醇將細(xì)胞固定，以triton-X 100及皂甙處理增加細(xì)胞膜通透性。然后以3%BSA阻斷，30 min后將玻片和alphatubulin的一抗反應(yīng)（濃度1∶100），再將玻片和帶有FITC的二級抗體（濃度1∶500）反應(yīng)。以不加一抗細(xì)胞作為陰性對照。最后用PI將細(xì)胞核染色，并觀察細(xì)胞周期。

1.3 基因芯片微陳列分析篩選差異基因

從不同劑量姜黃素處理過的癌細(xì)胞中萃取出RNA并分離之，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再對所反轉(zhuǎn)錄的cDNA與制備好的探針進(jìn)行雜交，并以酵素呈色，測量芯片上各探針位置的表現(xiàn)量。最后經(jīng)過掃描以擷取呈色影像。搭配GenePix 3.0軟件將所得影像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成數(shù)值資料。再用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件做統(tǒng)計分析進(jìn)行基因篩選。

1.4 驗證基因芯片微陳列分析篩選出的差異基因

利用實時定量RT-PCR驗證差異基因mRNA的表現(xiàn)量。以Primer express軟件設(shè)計待測基因引物，再以SYBR Green PCR master mix標(biāo)定cDNA而后以ABI 7700 Sequence Detection System進(jìn)行反應(yīng)。以驗證在RNA層次上，微數(shù)組分析結(jié)果的正確與否。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素具有抑制人舌癌細(xì)胞增殖與侵襲的能力

分別以0、5、10、20、30、60、100μmol·L-1姜黃素處理SCC-4癌細(xì)胞24 h，MTT法檢測顯示：超過20μmol·L-1濃度，姜黃素明顯地抑制細(xì)胞增殖；其50%抑制有效濃度為30μmol·L-1，在此濃度下，不會對正常細(xì)胞造成明顯的毒性作用（圖1），但在100μmol·L-1的姜黃素處理下，則對正常細(xì)胞有明顯的毒性作用。進(jìn)一步以Matrigel侵襲實驗觀察癌細(xì)胞侵襲能力的改變。結(jié)果顯示：姜黃素在20、30、60μmol·L-1時對SCC-4癌細(xì)胞的侵襲有明顯抑制作用（圖2）。

圖1 在不同濃度姜黃素的作用下SCC-4細(xì)胞的增殖活性Fig 1 Cell proliferation of SCC-4 cells in different doses of curcumin

流式細(xì)胞儀分析SCC-4癌細(xì)胞的細(xì)胞周期結(jié)果顯示：姜黃素在較低劑量（5、10μmol·L-1）對細(xì)胞周期的影響不顯著；然而，在20、30、60μmol·L-1的劑量下姜黃素對細(xì)胞周期的分布有顯著的作用。初步的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能讓細(xì)胞周期停留在G2/M期（圖3）。進(jìn)一步用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理后是否有細(xì)胞周期停頓的現(xiàn)象。結(jié)果顯示：姜黃素（30μmol·L-1）會造成SCC-4癌細(xì)胞的細(xì)胞支架中的alpha-tubulin產(chǎn)生聚集的現(xiàn)象，這會造成細(xì)胞分裂產(chǎn)生障礙，因而造成細(xì)胞周期停頓（圖4）。因此，課題組以能夠抑制SCC-4癌細(xì)胞增殖與侵襲的而且不會對正常細(xì)胞造成明顯的毒性作用的有效濃度（30μmol·L-1和60μmol·L-1）來進(jìn)行基因芯片微陳列分析。

圖2 在不同濃度姜黃素的作用下SCC-4細(xì)胞的侵襲能力Fig 2 Cell invasion of SCC-4 cells in different doses of curcumin

圖3 在不同濃度姜黃素的作用下SCC-4細(xì)胞的周期Fig 3 Cell cycle of SCC-4 cells in different doses of curcumin

圖4 姜黃素（30μmol·L-1）使SCC-4癌細(xì)胞的細(xì)胞支架中的alphatubulin產(chǎn)生聚集的現(xiàn)象 熒光顯微鏡 ×400Fig 4 The immunostaining indicated that alpha-tubulin was accumulated and might be aggregated in cell nuclus following curcumin treatment（30μmol·L-1） fluorescence microscope ×400

2.2 基因芯片微陳列分析差異基因頻譜

從前期的實驗中挑選2個濃度30μmol·L-1和 60μmol·L-1來做微陳列分析。結(jié)果顯示：有87個基因可被姜黃素誘導(dǎo)增加；相比之下，有198個基因的表現(xiàn)受姜黃素抑制。這些受調(diào)控的基因，包括有調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞表面抗原、細(xì)胞附著性蛋白、DNA合成、修復(fù)，重組蛋白質(zhì)、生長因子、細(xì)胞因子、激素受體，細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子、離子通道，與代謝途徑相關(guān)的蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、引發(fā)炎癥反應(yīng)的蛋白、胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)及EST（expressed sequence tags）基因。

2.3 實時定量RT-PCR驗證cDNA微陳列分析結(jié)果

從cDNA微陳列分析的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，一些受姜黃素調(diào)控的基因，可能與其抑制癌細(xì)胞生長或與轉(zhuǎn)移相關(guān)。于是從中選取其中10個基因（包括：cdc27、crystalline beta1、crystalline gamma、EGFR substrate 15、H2A histone、neurnal pentaxin、PG-EP synthase 2、PPAR-alpha、stromelysin-3和trypsinase IA），進(jìn)一步采用實時定量RT-PCR來驗證其在RNA水平上的表達(dá)，測其基因表現(xiàn)是否符合cDNA微陳列分析的結(jié)果。結(jié)果顯示，實時定量RT-PCR和微陳列分析的結(jié)果相符，這同時也說明這些與癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因受到了姜黃素的調(diào)控。

3 討論

舌癌是口腔常見惡性腫瘤之一，易復(fù)發(fā)或/和發(fā)生轉(zhuǎn)移，而且舌癌的初期臨床癥狀多不明顯，大部分患者在診斷時都可能已經(jīng)發(fā)生浸潤或轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究[5-6]表明：姜黃素具有預(yù)防及治療口腔癌的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)：姜黃素能降低SCC-4舌癌細(xì)胞的生長與侵襲能力，且此作用具有藥物劑量相關(guān)性。經(jīng)過cDNA微陳列分析后也發(fā)現(xiàn)：姜黃素抗舌癌細(xì)胞的增殖與侵襲的可能機(jī)制，為今后研究更多的抗癌藥物提供實驗依據(jù)。

實驗研究表明：姜黃素可以抑制老鼠巴豆酯誘導(dǎo)的皮膚腫瘤。在倉鼠的動物實驗[7]中亦發(fā)現(xiàn)：二甲基苯并蒽所引起的口腔上皮細(xì)胞癌變被姜黃素抑制。過去研究已顯示：姜黃素除了具有抗癌細(xì)胞增殖的效果，也具有抑制轉(zhuǎn)移的能力[6]：濃度低于每千克體重200 nmol的姜黃素在人體內(nèi)具有顯著抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力，且證實其能減少80%肺腫瘤，提高患者的存活時間；在黑色素腫瘤細(xì)胞B16F-10中，以27.14μmol·L-1濃度姜黃素處理，具有顯著抑制其侵襲Boyden小室基質(zhì)的能力[4]；在老鼠的實驗中，發(fā)現(xiàn)其具有抑制血管新生的能力[4]。盡管癌轉(zhuǎn)移研究報告相當(dāng)多，但整個癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前的研究仍無法完全明了。因此分析癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，進(jìn)而了解癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍然是目前癌癥研究的重要課題。以往的研究[4-7]表明：姜黃素的作用機(jī)制主要是影響信號轉(zhuǎn)錄的因子達(dá)到上述的功能。姜黃素也具有抑制細(xì)胞周期的功能，并能通過調(diào)節(jié)c-myc、bcl-2來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。在肺癌細(xì)胞中的研究指出，姜黃素抗肺癌主要是使NCAM、TOPO-I、TOPO-II、AXL tyrosinase表達(dá)降低，并抑制NF-kappa B轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，以往在口腔癌的相關(guān)研究[3-4]中發(fā)現(xiàn)：姜黃素的抗癌機(jī)制可能受多因素的調(diào)控，其中包括抗細(xì)胞增殖、抑制血管新生、抗氧化作用等。其調(diào)控的機(jī)制除了通過使轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下降來達(dá)到抗癌效果，還可以抑制酪氨酸激酶受體的活性[4]。

本研究以基因微陳列芯片和定量RT-PCR的技術(shù)證明，姜黃素可能通過調(diào)控一些與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因（cdc27、crystalline beta1、crystalline gamma、EGFR substrate 15、H2A histone、neurnal pentaxin、PG-EP synthase 2、 PPAR-alpha、stromelysin-3和trypsinase IA）來達(dá)到抗癌效果。在這些受姜黃素調(diào)控的基因中，cdc27、EGFR substrate 15、PPAR-alpha和H2A histone與細(xì)胞生長息息相關(guān)，cdc27主要位于細(xì)胞中心體附近，具有增殖細(xì)胞核抗原依賴聚合酶活性，將細(xì)胞中的cdc27去除會造成細(xì)胞生長停止在細(xì)胞周期的分裂期，這與本研究觀察到姜黃素會使SCC-4舌癌細(xì)胞停滯在G2/M期的結(jié)果是相符合的。近年來的研究[8]指出：H2A histone的磷酸化參與了細(xì)胞周期的M期，并與細(xì)胞分裂過程中染色體相關(guān)。其他研究[9]也顯示：PPARalpha、crystalline、pentaxin與stromelysin-3等都參與了細(xì)胞在G2/M期中細(xì)胞周期，并發(fā)現(xiàn)這些因子與一些癌癥有著密切的關(guān)系。本實驗顯示：這些基因受姜黃素的抑制，表明可能與姜黃素對口腔舌癌的抗癌作用有關(guān)。此外，一些參與細(xì)胞移動（包括細(xì)胞內(nèi)骨架和細(xì)胞外蛋白水解酵素）相關(guān)的基因stromelysin-3、pentaxin和trypsinase IA也會被姜黃素所抑制。其中，stromelysin-3又稱為基質(zhì)金屬蛋白酶-11（matrix metalloproteinase-11，MMP-11），其為癌細(xì)胞分泌的能降解癌細(xì)胞附近的基質(zhì)蛋白，有助于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要分子；MMP-11與其他的MMP家族（至少包括MMP-2、-7、-9、-10）發(fā)現(xiàn)與癌癥生成和預(yù)后相關(guān)；目前被視為治療癌癥和阻止癌細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的新藥治療目標(biāo)[10]。

姜黃素抑制口腔舌癌的機(jī)制可能是使cdc27、EGFR substrate 15、PPAR-alpha和H2A histone表達(dá)水平降低，從而使細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的M期，從而達(dá)到抗舌癌細(xì)胞增殖的作用；此外，姜黃素也會通過抑制MMP-11、pentaxin和trypsinase IA基因表達(dá)水平，從而抑制癌細(xì)胞的侵襲能力，達(dá)到抗轉(zhuǎn)移的作用，但舌癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的機(jī)制是相當(dāng)復(fù)雜的，是多基因參與多步驟的過程，還需不斷深入廣泛地研究。希望此研究對研究開發(fā)抗口腔癌新藥有一定的意義，以基因芯片進(jìn)行藥物作用機(jī)制研究，并建立藥物篩選平臺，可作為今后研究其他中草藥抗癌作用的參考。

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（本文編輯 胡興戎）

Anti-proliferative and anti-metastatic effects of curcum in on oral cancer cells

CHEN Jiao-wen,TANG Yaling,LIU Hong,ZHU Zhi-yu,LüDi,GENG Ning,CHEN Yu.（State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveThe purpose of this article is to examine the effect of curcumin on the proliferation and metastasis of human tongue squamous cell carcinoma and analyze its mechanism.MethodsSCC-4 were treated with curcumin of 0,5,10,20,30,60,100μmol·L-1in 24 h.MTT assay,Matrigel invasion assay,flow cytometry and fluorescence microscopy were used to examine the effect of curcumin on the growth and metastasis of SCC-4.cDNA microarray and RT-PCR were employed to analyze the expression of genes treated by curcumin.Results The results showed that curcumin could concentration-dependently inhibit SCC-4 cell proliferation at the concentration range from 20 to 100μmol·L-1.Furthermore,Matrigel invasion assay indicated that curcumin can reduce SCC-4 cell invasion under the dosage of 20,30,60μmol·L-1.Flow cytometry also showed that curcumin can influence the distribution of cell cycle of SCC-4 cell with the dosage of 20,30,60μmol·L-1.And the dosage of 30μmol·L-1curcumin could lead to the recruitment of alpha-tubulin.cDNA microarray showed that 87 genes were activated and 198 genes were inhibited with the effect of curcumin.These results were validated by the real time quantitative RT-PCR.ConclusionAccording to the results,it suggests that curcumin has the potential as the leading compound for anti-cancer proliferation and invasion in oral cancer treatment,and cdc27,EGFR substrate 15,PPAR-alpha and H2A histone may play an important role among this multiple anticancer-targeting ability.

tongue cancer； curcumin； proliferation； metastasis

R 739.86

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.020

1000－1182（2011）01－0083-04

2010-09-10；

2010-11-20

高等學(xué)校博士點學(xué)科專項科研基金資助項目（20090181-110059）

陳教文（1969—），男，2007級臺灣籍博士研究生

陳宇，Tel：028-85501465