閆清華,康 靜,楊 理,邵 強(qiáng)

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系,河南新鄉(xiāng)453003;2.河南科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心,河南新鄉(xiāng)453003;3.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453007)

抗凍蛋白(antifreeze protein,AFP)通過非共價吸附抑制機(jī)制吸附到冰核表面,限制冰晶生長和抑制冰晶重結(jié)晶,從而保護(hù)有機(jī)體免受結(jié)冰引起的傷害[1]。Gabriel A等[2]首次報道了在老鼠的心臟移植中,用抗凍蛋白低溫保藏心臟從而成功地保護(hù)了心肌結(jié)構(gòu)。2004年[3],以色列示巴女王醫(yī)學(xué)中心的研究人員利用抗凍蛋白對哺乳動物的心臟進(jìn)行低溫保存,不但延長保存時間,也使器官移植的成活率大大提高。AFP在低溫長期保存各種細(xì)胞、組織和器官,特別在器官移植中有很好的應(yīng)用前景[4-5]。另外,抗凍蛋白在食品,工業(yè),農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。

黃粉甲抗凍蛋白的天然表達(dá)水平很低,而且純化比較困難,需要經(jīng)過離子交換層析HPLC等步驟,而每一步又必須測定熱滯值來跟蹤檢測。因此,限制抗凍蛋白應(yīng)用的主要問題就是抗凍蛋白還無法形成規(guī)?；a(chǎn),不能滿足各行各業(yè)的應(yīng)用。本研究主要利用大腸埃希菌表達(dá)黃粉甲抗凍蛋白,通過對誘導(dǎo)溫度、初始菌濃度、IPTG濃度及誘導(dǎo)時間等條件進(jìn)行優(yōu)化組合,摸索出最佳的培養(yǎng)條件,并進(jìn)一步純化該蛋白,為擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模及滿足各行業(yè)對抗凍蛋白的需求奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌表達(dá)菌株TBI(含融合質(zhì)粒pMAL-p2X-afp84a)為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶及主要試劑 IPTG為Sangon公司產(chǎn)品;蛋白質(zhì)Marker,Amylose親和柱,Factor Xa因子等為NEB公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 黃粉甲抗凍蛋白AFP84a表達(dá)條件的優(yōu)化 首先對誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化,在3個關(guān)鍵溫度點(diǎn)(37、25、13℃)在對數(shù)生長期(OD600=0.6)分別進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)4、8、12 h;其次對初始菌濃度進(jìn)行優(yōu)化,初始菌濃度OD600分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0等5個梯度時,在25℃下分別進(jìn)行誘導(dǎo)8 h;最后對具有互作影響的IPTG的濃度和誘導(dǎo)時間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),采用IPTG的濃度為0.1、0.5、0.9 mmol/L 3個梯度,誘導(dǎo)時間為4、8、12 h 3個梯度進(jìn)行正交試驗(yàn),在溫度為25℃,初始菌濃度為OD600=0.6條件下進(jìn)行誘導(dǎo)。經(jīng)SDS-PAGE和Bandscan4.3軟件分析后,確定最優(yōu)的表達(dá)條件。

1.2.2 融合蛋白的收獲 按1∶100的比例接種1.0 mL重組菌菌液(TBI/pMAL-p2X-afp84a)于100 mL的高營養(yǎng)培養(yǎng)基中。37℃條件下震蕩培養(yǎng)至菌液OD600=0.6,加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,25℃下再震蕩培養(yǎng)8 h,然后4 000 r/min離心25 min,取沉淀細(xì)胞。用30 mmol/L的Tris-HCl,200g/L的蔗糖和pH8.0 1 mmol/L的EDTA溶液重懸細(xì)胞,室溫震蕩8 min。在4℃以8 000 r/min離心25 min,用13 mL預(yù)冷的5 mmol/L MgSO4溶解沉淀,在冰浴中震蕩8 min。在4℃以8 000 r/min離心15 min,取適量上清液進(jìn)行電泳檢測。

1.2.3 融合蛋白的純化 按Amylose親和柱說明書將收集到的上清液加入到柱床內(nèi),進(jìn)行親和層析,收集樣品洗脫液3管～5管(1 mL/管)。通過紫外光吸收法測定并計(jì)算出各管洗脫蛋白的濃度;最后用SDS-PAGE檢測。

1.2.4 Factor Xa酶切割融合蛋白 反應(yīng)體系按Factor Xa酶切說明書進(jìn)行。

1.2.5 目的蛋白的純化 按1.2.3的方法將切割完全融合蛋白的反應(yīng)液加入到Amylose親和柱內(nèi),層析純化并用SDS-PAGE和銀染法檢測洗脫樣品。

2 結(jié)果

2.1 黃粉甲抗凍蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)溫度對目的蛋白產(chǎn)量的影響 圖1顯示,25℃下誘導(dǎo)菌所產(chǎn)生的目的蛋白含量明顯比37℃和13℃時較多,因此較優(yōu)的誘導(dǎo)溫度是25℃。通過Bandscan4.3軟件分析,目的蛋白的百分含量依次為28.19%、27.95%、39.46%、39.68%,從中也可得到同樣的結(jié)果。由于一些細(xì)菌不穩(wěn)定蛋白在低溫時表達(dá)量更大,故25℃下誘導(dǎo)的菌所產(chǎn)生的目的蛋白含量較高,因25℃下細(xì)菌生長周期較長,所以需誘導(dǎo)的時間相對較長。

圖1 不同溫度誘導(dǎo)重組菌表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinant E.coli TBI induced with different temperature

2.1.2 初始誘導(dǎo)菌密度(A600)對目的蛋白表達(dá)量的影響 Bandscan4.3軟件對圖2進(jìn)行分析,目的蛋白百分含量依次為20.56%、22.14%、25.87%、24.50%、22.01%、11.89%(未加誘導(dǎo)劑的對照)。結(jié)果顯示,隨著起始菌體密度(A600)的增大,其誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量也逐漸增大,當(dāng)A600增至0.6時,誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量為最大,達(dá)到25.87%,當(dāng)A600繼續(xù)增大時,誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量卻逐漸減少。

圖2 不同初始A600誘導(dǎo)重組菌表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinant E.coli TBI induced with different initial bacterial concentrant

2.1.3 IPTG濃度與誘導(dǎo)時間的優(yōu)化 根據(jù)對誘導(dǎo)條件的優(yōu)化設(shè)計(jì),對IPTG濃度與誘導(dǎo)時間進(jìn)行正交試驗(yàn)(兩因素三水平)。圖3顯示IPTG濃度為0.5 mmol/L誘導(dǎo)8 h的菌所產(chǎn)生的目的蛋白含量最高,IPTG濃度為0.1 mmol/L誘導(dǎo)2 h的菌所產(chǎn)生的目的蛋白含量最低。通過Bandscan4.3軟件對電泳圖進(jìn)行分析可知誘導(dǎo)時間為8 h時,誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量隨著IPTG的濃度增加先增加后減少;IPTG的濃度為0.5 mmol/L時,誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量最高(40.5%);當(dāng)IPTG的濃度達(dá)0.9 mmol/L時,誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量卻有減少的趨勢,這與高濃度IPTG對細(xì)菌的生長有一定的抑制作用有關(guān)[6]。IPTG濃度為0.1 mmol/L和0.9 mmol/L時,誘導(dǎo)菌10 h的蛋白表達(dá)量最大,但0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)菌卻在8 h時目的蛋白表達(dá)量最大,10 h次之。

圖3 IPTG濃度與誘導(dǎo)時間正交誘導(dǎo)重組菌表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinant E.coli T BIinduced with the IP TG concentration and the orthogonal induction time

2.2 融合蛋白的純化

由圖4可知上清中含的目的融合蛋白的量較高,對上清進(jìn)行層析純化,通過SDS-PAGE和紫外吸收光檢測(波長280 nm和260 nm)及公式C(mg/mL)=1.45OD280—0.74OD260,計(jì)算各管中蛋白的濃度,第3管洗脫液的蛋白濃度最大(0.58 mg/mL),第四管次之(0.49 mg/mL)。

圖4 融合蛋白的純化電泳圖Fig.4 SDS-PAGE pattern of purified fusion protein

2.3 目的蛋白的純化

目的融合蛋白切割后,進(jìn)行再次層析純化。用SDS-PAGE(海波銀染法)檢測,由圖5可知純化的目的蛋白為單一條帶,說明表達(dá)的目的蛋白達(dá)到很高的純度,為以后對其應(yīng)用研究打下了基礎(chǔ)。

3 討論

由于不同的誘導(dǎo)條件在一定程度上決定了目的蛋白的最終得率,這與誘導(dǎo)溫度、初始菌濃度、誘導(dǎo)時間和IPTG濃度相關(guān),因而找到該目的蛋白優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件就非常必要。預(yù)實(shí)驗(yàn)證明,溫度和初始菌濃度對誘導(dǎo)菌的表達(dá)具有較大的單因素影響作用,而另外兩個因素IPTG濃度和誘導(dǎo)時間具有互作性,以這兩個因素為變量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析,從而確定溫度為25℃,初始菌濃度為OD600值為0.6左右,誘導(dǎo)時間為8 h,IPTG濃度為0.5 mmol/L為最優(yōu)的表達(dá)條件,最終使目的蛋白得到了高效表達(dá)(40.5%)。

圖5 目的蛋白純度電泳檢測圖Fig.5 SDS-PAGE of purity of the target protein

在大腸埃希菌中表達(dá)外源蛋白時,最常用的方法是采用融合表達(dá)的方式。本研究利用pMAL-p2X載體采用分泌型融合表達(dá)的方式,融合蛋白由載體蛋白與目的蛋白組成,該載體含有一段編碼麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的序列和蛋白酶識別位點(diǎn)的序列,可以利用MBP對麥芽糖的親和性達(dá)到用Amylose柱對融合蛋白的親和純化,融合蛋白純化后,通過Factor Xa(X)可將目的蛋白與MBP切割分離,有利于得到純度較高的目的蛋白,既快捷又方便。另外,分子質(zhì)量比較小的蛋白在SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色時,不能被酸或醇固定,還會從凝膠中洗脫下來。黃粉甲抗凍蛋白分子質(zhì)量比較小,結(jié)構(gòu)比較特殊,可能還有不同程度的糖基化,利用SDSPAGE檢測目的蛋白時,用考馬斯亮藍(lán)染色很難得到黃粉甲抗凍蛋白的條帶(資料未顯示)。Liou Y C等[7]在大腸埃希菌中表達(dá)一種84個氨基酸的黃粉甲抗凍蛋白時,是通過檢測目的蛋白的熱滯活性來跟蹤目的蛋白的。經(jīng)過反復(fù)研究,最終用銀染方法得到了單一的重組抗凍蛋白電泳條帶,純化出了目的蛋白,為以后進(jìn)一步擴(kuò)大抗凍蛋白的產(chǎn)量和應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。

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