宋佰芬,劉 哲,曹宏偉,馬金柱,徐 闖,崔玉東,朱戰(zhàn)波,黃玉蘭

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江大慶163319)

干擾素(interferon,IFN)是在特定的誘生劑作用下,由細(xì)胞分泌的具有一定的抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能等活性的糖蛋白[1]。根據(jù)IFN蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)、抗原性和細(xì)胞來(lái)源以及它們所結(jié)合受體的不同,可將IFN分為兩類(lèi),即Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN。Ⅰ型IFN常分為2個(gè)亞型,分別由白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生,可抑制病毒DNA和蛋白質(zhì)合成,活化NK細(xì)胞,促進(jìn)MHCI類(lèi)分子遞呈抗原。Ⅱ型干擾素又稱(chēng)為γ干擾素,主要由CD4+Th1型、CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞產(chǎn)生,它除了具有抗病毒、抗腫瘤活性外,更重要的是它還具有促進(jìn)MHCⅡ類(lèi)抗原表達(dá)、增強(qiáng)APC與T細(xì)胞的相互作用、增強(qiáng)T細(xì)胞輔助抗體產(chǎn)生和細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生的能力等諸多免疫調(diào)節(jié)活性[2]。

養(yǎng)牛業(yè)在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著相當(dāng)重要的地位,但是牛的一些烈性傳染病,尤其是病毒病嚴(yán)重威脅著養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。研究表明,BoIFN-γ是一種高活性、多功能的生物活性糖蛋白,具有強(qiáng)烈的免疫調(diào)節(jié)作用,對(duì)寄生在細(xì)胞內(nèi)的各種病原體均具有有效的抑制作用[3]。無(wú)論作為疫苗佐劑或其他類(lèi)型的生物制劑,BoIFN-γ均可明顯提高機(jī)體抗感染能力,并且具有安全、高效、無(wú)毒副作用等特點(diǎn)[4]。但在通常情況下,機(jī)體內(nèi)IFN-γ表達(dá)量甚微,不能直接提取純化[5]。因此,應(yīng)用IFN-γ作為疫苗佐劑或抗病毒性藥物,必須通過(guò)基因工程技術(shù)在體外生產(chǎn)重組IFN-γ。隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程和發(fā)酵與細(xì)胞工程的深入發(fā)展,大規(guī)模、高效率地生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的干擾素已成為可能,這將使人們把干擾素廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床,并為最終戰(zhàn)勝疾病提供充足的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)[6]。

因此,為了解決這一問(wèn)題我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了原核表達(dá)重組菌,對(duì)其進(jìn)行表達(dá)和純化,并免疫小鼠制備了多克隆抗體,為進(jìn)一步研究該蛋白的生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 青年健康黑白花奶牛;8周齡Balb/c小鼠。

1.1.2 宿主菌、載體 大腸埃希菌BL21、x-LI Blue由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存,載體pMD18-T、pQE-30為哈爾濱無(wú)限峰生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 工具酶和試劑 T rizol抽提試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品;DNA膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、EcoRⅠ、TaqDNA聚合酶、DL 2 000、DL 15 000、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;弗氏佐劑、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、刀豆蛋白(ConA)等為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中已發(fā)表的BoIFN-γ核苷酸序列,應(yīng)用DNA Star軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,引物上游加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)性堿基,下游引物加入了EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)性堿基,引物序列為:上游:BamHⅠ:GAGGGATCCATGAAATATACAAGCTAT;下游:EcoRⅠ:GACGAAT TCT TACGTTGATGCTCTCC。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為510 bp左右,包括BoIFN-γ信號(hào)肽的整個(gè)ORF,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 牛脾臟淋巴細(xì)胞的分離與誘導(dǎo)培養(yǎng) 無(wú)菌采集牛脾臟,快速將脾臟剪切、研磨,分離出單個(gè)細(xì)胞。離心后用每管5 mL Hank′s懸浮細(xì)胞,用膠頭滴管緩緩加入到5 mL淋巴細(xì)胞分離液中,具體方法參照淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。最后用含ConA濃度為7.5 μ g/mL的1640全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度到107個(gè)/mL,加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)18 h。

1.2.3 牛脾臟淋巴細(xì)胞總RNA的提取 經(jīng)Con A誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h后,離心收集淋巴細(xì)胞,之后,按T rizol Reagent說(shuō)明書(shū)上的操作方法進(jìn)行。

1.2.4 BoIFN-γ基因cDNA的合成 以提取的牛脾臟淋巴細(xì)胞總RNA為模板,參照寶生物工程(大連)有限公司的反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

1.2.5 BoIFN-γ基因的克隆及純化 PCR反應(yīng)體系為50 μ L。在PCR反應(yīng)管中分別加入cDNA模板10 μ L,5×PCR緩沖液10 μ L,特異上游引物0.5 μ L,EXTaq酶0.25 μ L,加滅菌超純水至50 μ L,置PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先94℃預(yù)變性2 min;然后94℃30 s,54.6℃30 s,72℃30 s,共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃結(jié)束反應(yīng),用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物。

根據(jù)DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將DNA置—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將純化后的目的片段與pMD18-T載體16℃連接30 min,然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,具體步驟參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[7]。小量制備重組質(zhì)粒DNA,按照堿裂解法進(jìn)行[7]。取少量重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定,并用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.7 序列測(cè)定 將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。用分析軟件DNA Star將測(cè)定結(jié)果與已知序列進(jìn)行比較分析,陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMD-BoIFN-γ。

1.2.8 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-IFN-γ,將目的基因切下,亞克隆到相同內(nèi)切酶處理過(guò)的表達(dá)載體pQE-30上,轉(zhuǎn)化x-LI Blue感受態(tài)細(xì)胞,涂布于LB固體培養(yǎng)基(含30 μ g/mL Kan),37℃培養(yǎng)過(guò)夜。常規(guī)方法提取重組質(zhì)粒,之后進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定,陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pQE30-IFN-γ。

1.2.9 重組蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性菌于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.8時(shí),用1.0 mmol/L IPTG于37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),而后取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.10 Western blot 經(jīng)SDS-PAGE電泳后,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜,抗His-Tag單克隆抗體室溫孵育1 h,PBST洗滌。1∶2 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG室溫孵育1 h,PBST洗滌,DAB顯色,進(jìn)行Western blot分析。

1.2.11 蛋白的回收、純化 參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.2.12 鼠免疫血清的制備 用純化的γ干擾素蛋白與弗氏佐劑混和,免疫8周齡Balb/c小鼠。具體免疫程序參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。將血液于37℃靜置1 h,再于4℃冰箱放置3 h～4 h。待血液凝固后,吸取血清,3 000 r/min離心14 min,取上清,分裝后置20℃保存。

1.2.13 ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià) 將純化的20 μ g/mL的γ干擾素蛋白包被ELISA板,每孔0.1 mL,4℃過(guò)夜,每孔再加封閉液0.1 mL,37℃靜置2 h,洗板5次,每孔加入倍比稀釋免疫血清(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000)0.1 mL,37℃反應(yīng)45 min,洗板5次,每孔再加入1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗,37℃反應(yīng)45 min,洗板,每孔加0.1 mL底物,室溫放置20 min。2 mol/L硫酸50 μ L終止反應(yīng),于96孔酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm吸光值。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果

PCR擴(kuò)增包含信號(hào)肽序列的BoIFN-γ基因片段,取5 μ L PCR產(chǎn)物12 g/L瓊脂糖凝膠電泳,電壓5 V/cm電泳,在紫外透射儀下可見(jiàn)到與預(yù)期條帶大小相符的BoIFN-γ為510 bp(圖1)。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

2.2 表達(dá)載體質(zhì)粒鑒定結(jié)果

為了驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否為陽(yáng)性,挑取藍(lán)白篩選后的白色菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1)和BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定(圖2)。結(jié)果擴(kuò)增出與預(yù)期的片段大小一致,而且為單一條帶,可以初步證明重組質(zhì)粒為陽(yáng)性。雙酶切鑒定,得到的片段與預(yù)期的片段大小一致,這表明鑒定的重組質(zhì)粒為陽(yáng)性。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion of recombinant plasmid

2.3 重組蛋白的SDS-PAGE電泳

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到x-LI Blue大腸埃希菌后,經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h,當(dāng)OD600值為0.6～0.8之間時(shí),收集菌液,離心,棄上清洗滌2次～3次,加入上樣緩沖液,煮沸后上樣,每孔上樣10 μ L,然后開(kāi)始100 g/L SDS-PAGE電泳。結(jié)果與對(duì)照樣品相比,重組x-LI Blue大腸埃希菌表達(dá)出大小為22 ku的蛋白條帶(圖3)。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE results of expressed products

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果

將SDS-PAGE電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,經(jīng)Anti-His-Tag一抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG的二抗反應(yīng),最后經(jīng)DAB顯色,結(jié)果在22 ku處檢測(cè)到表達(dá)的蛋白質(zhì)條帶(圖4)。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Analysis of expressed products by Western blot

2.5 鼠血清抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

血清按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000比例稀釋,陰性對(duì)照為未注射該蛋白的小鼠血清。ELISA結(jié)果表明,小鼠的抗體效價(jià)均在1∶32 000以上,免疫效果較好(表1)。

表1 IFN-γ免疫血清的測(cè)定結(jié)果T able 1 Detection results of immunized IFN-γserum antibody in mice

3 討論

IFN-γ是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子,主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-γ對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用,是機(jī)體發(fā)揮免疫功能、清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分[10-11]。因此,IFN-γ在疾病的診斷、治療和疫苗免疫效果檢測(cè)等方面具有重大作用,是現(xiàn)代分子生物學(xué)、免疫學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

INF-γ是在特定的誘生劑作用下,由機(jī)體自身產(chǎn)生的一種維持機(jī)體自我穩(wěn)定的防御性物質(zhì)。常見(jiàn)的誘生劑包括兩種:一種是促細(xì)胞分裂劑,如植物血凝素(PHA)、刀豆素(ConA)、商陸(Poke-weed)、細(xì)菌脂多糖(LPS)、葡萄球菌腸毒素(SEA);另一種是特異性抗原,如結(jié)核菌素、破傷風(fēng)毒素、腫瘤細(xì)胞等。本研究中用Con A體外誘導(dǎo)牛外周血淋巴細(xì)胞后再抽提細(xì)胞總RNA,用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了BoIFN-γ基因。刀豆素蛋白A(ConA)是一種能使高比例的淋巴細(xì)胞活化的多克隆激活劑[7]。刺激淋巴細(xì)胞活化后,IFN-γ可在0.5 h～20 h開(kāi)始表達(dá)[12]。但本試驗(yàn)在用Con A刺激4 h左右的時(shí)候開(kāi)始提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,未獲得成功,這可能和我們培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞活性及刺激濃度有關(guān),也可能是IFN-γ表達(dá)量不夠所造成的。后來(lái)我們用Con A刺激18 h時(shí)提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增而獲得成功的。將擴(kuò)增出的BoIFN-γ基因的cDNA片段連接到pMD18-T載體上測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,與GenBank中已發(fā)表的序列同源性為99.8%。然后將其連接到原核表達(dá)載體pQE-30中,通過(guò)將克隆的牛γ干擾素基因定向插入原核表達(dá)載體pQE-30的相應(yīng)位點(diǎn),轉(zhuǎn)化x-LI Blue表達(dá)菌株,進(jìn)行誘導(dǎo),結(jié)果成功獲得了表達(dá)。取樣重組菌體,煮沸裂解后,將上清和菌體裂解產(chǎn)物分別上樣電泳,證明牛γ干擾素蛋白為可溶性表達(dá)。并且蛋白的表達(dá)量較大。為后續(xù)的純化帶來(lái)了方便,為免疫接種提供了良好的條件。將該蛋白免疫小鼠后獲得的多克隆抗體,經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,該抗體效價(jià)在1∶32 000以上,說(shuō)明該蛋白具有很好的免疫原性,為進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

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