王 博，許修宏，袁 立

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

雙孢蘑菇系擔(dān)子菌亞門傘菌目蘑菇科真菌，作為食用菌栽培已有300多年歷史，為世界第一大商業(yè)栽培菇種。隨著栽培量的逐漸增大，其菌種的生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量的要求也相應(yīng)提高。在中國，由于保藏菌種的條件不是很高，菌種的老化問題很嚴(yán)重，直接影響了菌種的質(zhì)量，雙孢蘑菇的產(chǎn)量也受到影響。隨著菌齡的增長，菌種的活力等各方面特性都相應(yīng)下降，即菌絲老化。因而探索出菌絲老化的機(jī)理和檢測菌絲老化的狀態(tài)是科研工作和生產(chǎn)實(shí)踐中迫切需要解決的問題。

真菌的老化問題在近年在國內(nèi)鮮有研究，在國外主要集中在（Podospora anserina）、（Neurospora）等模式真菌[1-2]，其老化的原因主要與線粒體DNA（mtDNA）改變有關(guān)。對雙孢蘑菇的營養(yǎng)菌絲老化問題卻鮮有研究，有不少學(xué)者集中于雙孢蘑菇子實(shí)體的老化現(xiàn)象的研究。Halit等對老化的菌絲做了形態(tài)學(xué)觀察，得出結(jié)論，老化是一個以時間為順從性的、相對緩慢的變化過程，因此在適當(dāng)?shù)臅r間，可以觀察出明顯的形態(tài)學(xué)變化[3]。本文對雙孢蘑菇的營養(yǎng)菌絲體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并加以分析，為今后鑒別菌種的老化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株As2796由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

一級種采用普通PDA培養(yǎng)基，pH為7.0；二級種采用小麥培養(yǎng)基，含水量45%，混合2%石膏，每瓶裝入優(yōu)質(zhì)小麥粒200 g，17.65×104Pa高壓滅菌2 h[4]。

1.3 供試菌種的培養(yǎng)和形態(tài)觀察

把等量的一級種接種到小麥培養(yǎng)基中，于24℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱在使用前徹底消毒，以免培養(yǎng)前期污染雜菌。

分別接種5批，每隔30 d接種一批。選取第一批菌種做形態(tài)學(xué)觀察試驗(yàn)。

挑取少量菌落使用5%結(jié)晶紫染色5 min[3]，于1000倍顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.4 不同菌齡菌株的活力試驗(yàn)

分別用菌齡30、60、90、120、150、180 d的小麥菌種接種PDA平板中央，觀測其萌發(fā)時間、長速。作3次重復(fù)，取平均值。

1.5 不同菌齡總RNA含量的測算

采用Trizol法提取菌絲的中的總RNA，并用DNAⅠ（Rnase free）進(jìn)行RNA的純化，在紫外分光光度計(jì)下測出OD值，然后計(jì)算含量[5]。重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算出OD260/280的比值，檢測RNA的質(zhì)量；并用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的菌絲RNA進(jìn)行完整性測試[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌齡的觀察

當(dāng)菌齡達(dá)到10 d時，菌絲形態(tài)均勻，細(xì)胞壁光滑，層次單一，單一菌絲細(xì)胞之間的連接非常緊密，隔膜間距離較大（見圖版Ⅰ-1）。宏觀觀察菌絲生長至7～8 cm，菌絲生長旺盛，菌勢白壯。菌齡達(dá)到30 d左右，菌絲形態(tài)變化不大（見圖版Ⅰ-2），這時菌絲已經(jīng)長滿麥粒培養(yǎng)基。菌齡60 d左右，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大變化，一部分菌絲形態(tài)微微膨脹（見圖版Ⅰ-3），尤其在細(xì)胞隔膜處較為明顯，細(xì)胞隔膜間連接不再緊密，類似于竹節(jié)狀（見圖版Ⅰ-4），這個時期此類形態(tài)菌絲較多，并且培養(yǎng)基中菌絲吐黃水現(xiàn)象較為嚴(yán)重。菌齡90 d左右，許多菌絲不再是原有的形態(tài)，有些細(xì)胞壁變得粗糙，不規(guī)則，許多菌絲的細(xì)胞壁表面附著密集的顆粒狀物質(zhì)（見圖版Ⅰ-6）。有些細(xì)胞形態(tài)粗大，細(xì)胞壁呈現(xiàn)出一種腫脹的狀態(tài)（見圖版Ⅰ-5）。菌齡達(dá)到120 d左右，越來越多的菌絲細(xì)胞壁附著著顆粒狀物質(zhì)（見圖版Ⅰ-7），同時存在著嚴(yán)重變形的菌絲細(xì)胞，猶如植物細(xì)胞液泡（見圖版Ⅰ-8），這種細(xì)胞在吐黃水的區(qū)域較為常見。當(dāng)菌齡達(dá)到150 d左右，菌絲絕大多數(shù)已失去原有形態(tài)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)幾乎消失，形成趨于瓦解形態(tài)，但并沒有完全消融，仍然保留著絲狀形態(tài)（見圖版Ⅰ-9）。圖版Ⅰ-10為放大的單獨(dú)菌絲，細(xì)胞壁外表粗糙，有大量類似于小顆粒狀物密集排列，整個細(xì)胞形態(tài)趨于瓦解。

經(jīng)觀察表明菌絲在培養(yǎng)50～60 d后，菌絲中開始出現(xiàn)細(xì)胞脹大、細(xì)胞壁變形等現(xiàn)象，并且隨著時間的增長這類菌絲的比例越來越大。因此雙孢蘑菇菌絲老化時間可能是從接種后的50～60 d開始的。隨著菌絲菌齡的增長，老化現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。

細(xì)胞生物學(xué)表明，隨著細(xì)胞的衰老，菌絲形態(tài)發(fā)生變化，色素的沉積明顯增大，這些現(xiàn)象表明菌絲已經(jīng)開始老化。這可能是因?yàn)榻z狀真菌細(xì)胞的生長集中在細(xì)胞頂端，衰老部分不會生長，為生長頂端運(yùn)送養(yǎng)分，細(xì)胞壁較厚；衰老部分新陳代謝分泌的色素逐漸沉積，使菌絲產(chǎn)生黃水。衰老細(xì)胞常發(fā)生水分減少的現(xiàn)象，結(jié)果使細(xì)胞收縮，體積縮小，失去了正常的細(xì)胞形態(tài)，另外生命體的衰老是以總體細(xì)胞的衰老為基礎(chǔ)的，因此培養(yǎng)基中觀察宏觀的菌絲呈現(xiàn)出體積減小，塌壁的現(xiàn)象。

圖版I 不同菌齡菌絲觀察Plate I Observation of mycelium of different spawn age

2.2 不同菌絲菌齡萌發(fā)時間和生長速度

使用不同菌齡的菌種分別接種PDA培養(yǎng)基，測量其萌發(fā)時間和平均生長速度。菌齡為30 d的小麥粒菌種萌發(fā)時間為1.5 d，隨著接種的菌齡時間增加，菌絲的萌發(fā)時間逐漸變長（見圖1），菌齡150 d的菌種萌發(fā)時間到達(dá)了5 d。老化的菌絲活性較弱，需要更長時間來適應(yīng)接種后的新環(huán)境，因此萌發(fā)時間會變長。

圖1 不同菌齡對萌發(fā)時間的影響（AS2796）Fig.1 Effect of different spawn age on spawn germination time

接種30 d菌齡的小麥粒菌種平均長速最快為1.8 cm·d-1，隨著接種菌齡的增加，菌絲的長速逐漸減緩，接種150 d的菌種平均長速為0.96 cm·d-1（見圖2）。菌絲的老化細(xì)胞的活性降低，生長速度也會受到影響。

2.3 不同菌齡總RNA含量的對比

不同菌齡的菌絲中RNA含量的差異較大，菌齡年輕的菌絲RNA含量較豐富，菌齡30 d的菌絲RNA含量最大，為2231.2 ng·μL-1，菌齡150 d時RNA含量很低，僅為438.9 ng·μL-（1見圖3）。這可能是因?yàn)榇藭r的菌絲結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁的完整性破壞，細(xì)胞內(nèi)RNA降解，另一方面菌絲的老化導(dǎo)致RNA的合成能力降低。

平均菌齡30～150 d的OD260/OD280分別為:1.97、1.87、1.98、1.89、1.81。OD260/OD280均在1.8～2.0之間，因此RNA純度較高。

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，除150 d菌絲RNA外，其他菌絲RNA完整性均比較好（見圖4）。

圖2 不同接種菌齡對菌絲生長速度的影響（AS2790）Fig.2 Effect of different inoculating spawn age on mycelial growth rate

圖3 不同菌齡對RNA含量的影響（AS2790）Fig.3 Effect of different spawn age on content of mycelial RNA

圖4 總RNA電泳Fig.4 Electrophoresis pattern of total RNA

3 討 論

生命周期中機(jī)體成熟和死亡之間的一個階段，稱之為機(jī)體老化。在真菌中為從生長速度開始減緩直到死亡的階段，這是一個逐漸衰變的的過程[7]，即為真菌的老化。雙孢蘑菇的生長周期中分為營養(yǎng)生長和生殖生長，營養(yǎng)生長需要一定條件的刺激才能轉(zhuǎn)換為生殖生長，如果沒有刺激，其菌絲就會在基質(zhì)中一直生長下去，直到衰老死亡為止。本試驗(yàn)菌絲在培養(yǎng)150 d之后菌絲仍然有生長的能力，只是生長活力大大減弱，該現(xiàn)象說明雙孢蘑菇菌絲的老化是一個非常緩慢的過程。

蘑菇菌絲的營養(yǎng)生長主要分為三個階段[8]:第一階段為緩慢生長期:接種后，菌種對新環(huán)境要逐漸適應(yīng)，所以出現(xiàn)了生長緩慢的現(xiàn)象，時間一般在接種后的一周之內(nèi)。第二階段為快速生長期:這時菌絲已經(jīng)適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，可生長的菌絲量也很大，因此生長較快。第三階段為停滯生長期:在快速生長期之后，由于基質(zhì)中養(yǎng)分的耗盡，氧氣的缺乏，代謝產(chǎn)物的積累，使菌絲不能再正常的生長。宏觀整體形態(tài)上表現(xiàn)為出現(xiàn)大量的色素和菌被，菌絲干縮。在顯微形態(tài)上表現(xiàn)為出現(xiàn)大量的腫脹變形細(xì)胞，一部分細(xì)胞出現(xiàn)空包，甚至破裂；同時出現(xiàn)一些細(xì)胞壁附著有小顆粒狀的菌絲。這是老化的開始，隨著時間的推移這類現(xiàn)象會逐漸增加。

菌絲體的生長點(diǎn)在頂端，菌絲的衰老部分是不能生長的。依據(jù)絲狀真菌頂端生長的泡囊學(xué)說，菌絲頂端的泡囊聚集導(dǎo)致了頂端的延伸生長，然而細(xì)胞質(zhì)的流動為泡囊的向頂端的移動提供了一定的驅(qū)動力[9]。在菌絲中的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器一起形成細(xì)胞質(zhì)流，向菌絲的頂端流動，也就是從衰老部分向新生部分流動，這是由于衰老部分逐漸硬化與逐漸擴(kuò)大的液泡壓力，驅(qū)使菌絲的原生質(zhì)從衰老的部位向頂端移動。菌絲的液泡會隨著菌齡的增大而增加，隨著菌絲的老化，液泡充幾乎滿了整個細(xì)胞，大量的細(xì)胞質(zhì)流被擠向頂端新生部位[10]。然而營養(yǎng)的缺乏會導(dǎo)致菌絲中液泡的生成[11]。隨著營養(yǎng)的不斷耗盡，細(xì)胞液泡變大、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致了細(xì)胞分泌物的增多或細(xì)胞內(nèi)含物的流出。這可能是菌齡較大的部位滲出較多黃水的原因，也同樣反映了細(xì)胞脹大的原因。

菌絲體的細(xì)胞壁也同時經(jīng)歷著老化，老化的菌絲的細(xì)胞壁要比年輕的細(xì)胞壁要厚[12]，并且Katz，Gull等多名學(xué)者認(rèn)為，老化細(xì)胞壁和年輕的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成不同，這種組成結(jié)構(gòu)的不平衡性是老化造成的[13-14]。正是這種不平衡性導(dǎo)致了形態(tài)上的差異，造成這種不平衡性的原因主要分為內(nèi)部和外部原因:內(nèi)部原因包括細(xì)胞器的突變和有毒物質(zhì)的積累；外部原因包括物理和化學(xué)的因素、營養(yǎng)的匱乏、一些酶類對細(xì)胞壁的影響。

老化的菌絲由于細(xì)胞內(nèi)部的改變和外部營養(yǎng)匱乏等因素，菌絲的活力明顯的下降，接入新的培養(yǎng)基中萌發(fā)時間增長，生長速度減緩，菌勢也不如菌齡年輕菌絲強(qiáng)。在菌絲生長的不同時期，處于停滯生長期的菌絲對于快速生長期的菌絲，合成RNA和蛋白質(zhì)的能力產(chǎn)生了不可逆的下降，有些下降15%～20%[15]。這種能力在不同菌齡的菌絲中產(chǎn)生差異，最終導(dǎo)致了較大菌齡菌絲中RNA含量下降。

雙孢蘑菇菌絲的老化現(xiàn)象在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)、生化學(xué)上的關(guān)系是顯而易見的。但是究竟是菌絲老化過程中生理生化的改變誘發(fā)了菌絲的老化，還是環(huán)境的改變使菌絲更易于老化，這個問題還有待深入探究。

4 結(jié)論

雙孢蘑菇菌絲老化開始時間可能是接種后的50～60 d。隨著菌絲菌齡的增長，老化現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。隨著接種菌絲的菌齡增大，菌齡30 d的菌絲對比150 d的菌絲，菌絲的萌發(fā)時間從1 d增長至5d；菌絲的生長速度從1.8 cm·d-1降到0.96 cm·d-1；RNA 含量從 2231.2 ng·μL-1下降到438.9 ng·μL-1。

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