張向東，楊 謙，余 佳，趙 磊，范金霞

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150001）

蛋白質(zhì)資源短缺是全世界面臨的重大難題，各國都很重視開發(fā)新型蛋白資源的研究。單細(xì)胞蛋白，是指非致病性真菌、酵母細(xì)菌等單細(xì)胞微生物體內(nèi)所含蛋白質(zhì)。含量高達(dá)細(xì)胞干重的45%～74%，且各種氨基酸搭配合理、種類齊全，維生素豐富等[1]。日益成為諸多科研工作者研究的重心[2-3]。單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)以食品工業(yè)廢料[4-5]、農(nóng)副產(chǎn)品下腳料及農(nóng)作物纖維等為主要原料[6-7]，不僅來源廣泛、生產(chǎn)成本低廉，而且對(duì)要求日益嚴(yán)格的環(huán)保問題，也體現(xiàn)著不可估量的價(jià)值[8]。我國千余家馬鈴薯淀粉廠每年產(chǎn)生的馬鈴薯薯渣與汁水超過340萬t，薯渣與汁水中營養(yǎng)豐富含有大量的纖維素半纖維素，氨基酸、維生素、粗蛋白、微量元素等[9-10]，汁水的 COD（Chemical oxygen demand）在25000～30000之間。由于缺乏科學(xué)有效的處理技術(shù)，使淀粉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的薯渣和污水任意排放，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，產(chǎn)生不良的社會(huì)影響[11]。本研究以短小芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，以馬鈴薯薯渣與汁水為原料，在不添加任何其他成分的情況下，初步獲得了以馬鈴薯薯渣與汁水為原料生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的方法，所獲得的發(fā)酵產(chǎn)物中精蛋白含量高，氨基酸組成均衡。在小鼠采食量與增重測(cè)試中均表現(xiàn)出優(yōu)于同等質(zhì)量豆粕。因此，本項(xiàng)工藝不僅解決環(huán)境污染的問題同時(shí)又生產(chǎn)了優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞蛋白，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與大小鼠

短小芽胞桿菌（B.pumilus）ZY05是本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種，Wistar大鼠、昆明白小鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:每1000mL中含有蛋白胨10 g；酵母提取物5 g；NaCl 10 g；pH 7.0，制作固體培養(yǎng)基時(shí)需加入20 g瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯薯渣與汁水半固體培養(yǎng)基（大興安嶺麗雪精淀粉公司），依照生產(chǎn)實(shí)際比例混合。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備

從斜面上挑取1環(huán)短小芽胞桿菌（B.pumilus）接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h。菌液經(jīng)離心以及去離子水清洗后，再用去離子水稀釋至OD6001.0作為種子。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物中精蛋白含量的測(cè)定

應(yīng)用雙縮脲法測(cè)定精蛋白的含量[12]。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸組成的測(cè)定

應(yīng)用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸的組成[13]。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物中胰蛋白酶抑制因子含量的測(cè)定

胰蛋白酶抑制因子含量的測(cè)定具體見參考文獻(xiàn)[14]。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物急性毒理試驗(yàn)

選用Wistar大鼠20只，雌雄各半，體重為180～220 g。采用最大耐受量試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)大鼠在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境3 d，禁食16 h后經(jīng)口一次灌胃，樣品用羧甲基纖維素做成混懸液灌胃，大鼠的灌胃容積為20mL·kg-1BW，灌胃劑量為10 g·kg-1BW。觀察大鼠的中毒表現(xiàn)和死亡時(shí)間，觀察時(shí)間為14 d。

1.2.6 鼠糧的制作

鼠糧配方如下表1所示。

表1 鼠糧配方Table1 Rat food formula (%)

鼠糧配置方法:首先配置不含有氮源的半成品鼠糧，根據(jù)試驗(yàn)的需要分別以同質(zhì)量的薯渣、豆粕與短小芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物作為氮源制作塊狀成品鼠糧。

1.2.7 發(fā)酵產(chǎn)物小鼠日采食量與增重的測(cè)定

取60只（雄雌各半）出生20 d小鼠，均分成3大組，每組20只雄雌各半，小鼠禁食水24 h后編號(hào)喂水喂食，通過超量投擲鼠糧、每4 d計(jì)算鼠糧減少量可知小鼠在單位時(shí)間內(nèi)的采食量。同時(shí)測(cè)量小鼠體重增加量。

測(cè)得數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2003運(yùn)算并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)酵時(shí)間對(duì)精蛋白產(chǎn)量的影響

短小芽孢桿菌1%接菌量（體積比），在30℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，從圖1可知精蛋白在120 h出現(xiàn)高峰達(dá)到發(fā)酵后干物質(zhì)總重量的17.81%。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)精蛋白產(chǎn)量的影響

短小芽孢桿菌1%接菌量（體積比），分別于20、25、28、30、33、37、40 ℃培養(yǎng)，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵120 h測(cè)量精蛋白含量，從圖2可知37℃發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液中的精蛋白含量最高達(dá)到發(fā)酵后干物質(zhì)含量18.8%。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)精蛋白產(chǎn)量的影響Fig.1 Influence of fermentation time on protein yield

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)精蛋白產(chǎn)量的影響Fig.2 Influence of fermentation temperature on protein yield

2.3 發(fā)酵通氣量對(duì)精蛋白產(chǎn)量的影響

短小芽孢桿菌1%接菌量（體積比），在37℃分別于90、120、150、180、210、240、300 r·min-1振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵120 h測(cè)量精蛋白含量，從圖3可知，在振蕩培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)速在180 r·min-1時(shí)精蛋白產(chǎn)量最大達(dá)到發(fā)酵后干物質(zhì)含量19.5%（見圖3）。

2.4 接菌量對(duì)精蛋白產(chǎn)量的影響

短小芽孢桿菌分別以0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2.0%的接菌量（體積比），在37℃分別于180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵120 h測(cè)量精蛋白含量，從圖4可知，接菌量分別為0.8%、1%、1.5%、2.0%時(shí)單細(xì)胞蛋白含量區(qū)別很?。ㄒ妶D4）。

圖3 發(fā)酵通氣量對(duì)精蛋白產(chǎn)量的影響Fig.3 Influence of fermentation ventilation on protein yield

圖4 接菌量對(duì)精蛋白產(chǎn)量的影響Fig.4 Influence of inoculation quantity on protein yield

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸組成分析

短小芽孢桿菌以0.8%的接菌量（體積比），在37℃，180 r·min-1下振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵120 h測(cè)量氨基酸組成，由表2可知，發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸組成均衡全面。

表2 氨基酸組成分析Table2 Amino acid composition analysis （%）

2.6 胰蛋白酶抑制因子活性

胰蛋白酶抑制因子是主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，發(fā)酵后胰蛋白酶抑制因子活性降低68%（見圖5）。提高了營養(yǎng)成分的吸收效率及適口性。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)胰蛋白酶抑制因子的影響Fig.5 Influence of fermentation time on TI

2.7 發(fā)酵產(chǎn)物的急性毒理試驗(yàn)

大鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表3，可知發(fā)酵產(chǎn)物不含有急性毒性成分。

2.8 小鼠平均采食量試驗(yàn)

小鼠的平均采食量見圖6。由圖6可知，小鼠對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的日采食量優(yōu)于同等質(zhì)量的豆粕，小鼠采食量的增加有利于小鼠吸收更多的營養(yǎng)。

2.9 小鼠平均增重試驗(yàn)

小鼠的平均增重見圖7。由圖7可知，食用薯渣發(fā)酵產(chǎn)物的小鼠平均增重優(yōu)于食用同等質(zhì)量豆粕的小鼠，平均增重是表現(xiàn)飼料品質(zhì)的重要方面，薯渣發(fā)酵產(chǎn)物可替代豆粕作為飼料應(yīng)用于動(dòng)物飼養(yǎng)。

表3 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table3 Rats acute toxicity tests results

圖6 小鼠平均采食量Fig.6 Mice average intake

3 討論

國內(nèi)外利用馬鈴薯生產(chǎn)淀粉過程中，均產(chǎn)生大量的薯渣和汁水，馬鈴薯薯渣和汁水的主要成分是纖維素和蛋白質(zhì)等。由于在生產(chǎn)淀粉過程中，需要添加一些化學(xué)物質(zhì)，適口性差，因此產(chǎn)生的薯渣不能直接被畜禽利用，馬鈴薯薯渣不能直接作為動(dòng)物飼料。而汁水COD高達(dá)25000～30000，馬鈴薯薯渣與汁水的處理一直是世界性的難題。馬鈴薯薯渣與汁水中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)能夠通過微生物發(fā)酵獲得單細(xì)胞蛋白，本研究優(yōu)化了利用短小芽孢桿菌發(fā)酵馬鈴薯薯渣與汁水生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞蛋白的工藝，結(jié)果獲得的發(fā)酵物中精蛋白含量達(dá)到19.23%，氨基酸全面均衡。

圖7 小鼠平均增重Fig.7 Mice average weight gain

抗?fàn)I養(yǎng)因子[15]破壞營養(yǎng)成分，阻礙營養(yǎng)成分的消化吸收，抗?fàn)I養(yǎng)因子還直接影響飼料的適口性，嚴(yán)重影響蛋白飼料的品質(zhì)。胰蛋白酶抑制因子是最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，薯渣與汁水發(fā)酵后胰蛋白酶抑制因子活性降低68%，小鼠在以薯渣為氮源的鼠糧中平均日采食量為2.04 g，在以豆粕為氮源的鼠糧中平均日采食量為2.74 g，在以短小芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物為氮源的鼠糧中平均日采食量為2.93 g；在小鼠采食量方面發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)于豆粕，采食量在一定程度上反應(yīng)了飼料的適口性，能夠增加小鼠的采食欲望。通過小鼠的飼養(yǎng)試驗(yàn)可知小鼠在以薯渣為氮源的鼠糧中平均增重為12.6 g，小鼠在以豆粕為氮源的鼠糧中平均增重為17.3 g，小鼠在以短小芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物為氮源的鼠糧中平均增重為20.9 g；通過小鼠采食量與增重試驗(yàn)可知薯渣與汁水的發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)于同等質(zhì)量的豆粕，能夠替代傳統(tǒng)的豆粕飼料。本工藝如能得到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用將極大的改變我國飼料蛋白短缺的現(xiàn)狀[16]。

通過大鼠急性毒理試驗(yàn)以及小鼠的28 d飼養(yǎng)試驗(yàn)可知發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)物安全無毒，作為蛋白飼料可以放心使用，在解決環(huán)境污染問題的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了資源的綜合利用。

4 結(jié)論

a.通過短小芽孢桿菌對(duì)馬鈴薯薯渣與汁水的發(fā)酵條件的單因子分析可知最佳發(fā)酵條件即0.8%的接菌量（體積比），37℃于180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵120 h。

b.通過對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物精蛋白質(zhì)含量以及氨基酸組成分析，馬鈴薯薯渣與汁水發(fā)酵后精蛋白含量達(dá)到干物質(zhì)含量的19.23%，氨基酸組成全面，具有作為蛋白飼料的潛力。

c.發(fā)酵產(chǎn)物通過大鼠急性毒理試驗(yàn)與小鼠28 d飼養(yǎng)試驗(yàn)證明無毒無害。

d.通過小鼠采食量與增重試驗(yàn)可知所獲得發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)于同等質(zhì)量的豆粕，獲得的高品質(zhì)單細(xì)胞蛋白實(shí)現(xiàn)了廢棄物的資源化，能夠替代豆粕，具有良好的應(yīng)用前景。

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