王喜波，遲玉杰,2*，胥 偉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

超聲處理技術(shù)在食品加工領(lǐng)域已有應(yīng)用，如食品體系的乳化、殺菌、破碎、萃取功能成分、干燥、檢測等[1-5]。近幾年來，隨著各種不同型號超聲設(shè)備的研制和完善，超聲處理技術(shù)已漸成為食品工業(yè)中研究與開發(fā)的重點(diǎn)新型技術(shù)之一[6]。利用超聲技術(shù)處理乳清蛋白的研究報(bào)道較多[7-9]，如改善和提高乳清蛋白的溶解性、起泡性等，但是關(guān)于超聲輔助琥珀酰化處理大豆蛋白以提高其功能性質(zhì)的影響研究很少。

大豆蛋白具有較高的營養(yǎng)價值和重要的功能性質(zhì)[10-13]，因而在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。但是天然大豆蛋白的功能性質(zhì)較差，無法滿足食品加工的需求，必須對其進(jìn)行適度的改性[14-15]。蛋白質(zhì)改性的方法很多，如物理、化學(xué)、生物酶等方法[16-18]，目前這些改性方法多數(shù)處于研究階段，較少用于實(shí)際生產(chǎn)。?；男允翘岣叽蠖沟鞍坠δ苄再|(zhì)的有效化學(xué)改性方法[19-20]，改性產(chǎn)物的溶解性、乳化性都有一定程度的增加[21]，但采用超聲輔助?；男约夹g(shù)提高大豆蛋白功能性質(zhì)鮮有報(bào)道。

本文將物理改性與化學(xué)改性技術(shù)相結(jié)合，利用超聲技術(shù)輔助琥珀?；男源蠖沟鞍仔鹿に嚕芯績?yōu)化改性條件、建立影響大豆蛋白乳化性因素間數(shù)學(xué)模型、探索改性前后蛋白分子特點(diǎn)變化，為建立適宜生產(chǎn)推廣的高乳化型大豆蛋白改性新技術(shù)提供技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

大豆蛋白（蛋白含量85%）:哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；大豆油:北海糧油工業(yè)（天津）有限公司；琥珀酸酐:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）為化學(xué)純；其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

噴霧干燥機(jī)（BüChi Spray Dryer（瑞士））；2501 PC紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；FS-1可調(diào)高速勻漿機(jī)（金壇市榮華儀器制造有限公司）；LD4-2A型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；JY92-2D超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；F-4500熒光分光光度計(jì)（日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 普通琥珀?；男源蠖沟鞍坠に?/p>

將大豆蛋白（Soybean proteins，SP）溶于蒸餾水中按試驗(yàn)設(shè)計(jì)配成一定濃度，調(diào)整溶液pH 8.0，將琥珀酸酐（Succinic anhydride，SCA）試劑三等分，分別間隔5 min加入蛋白溶液中，反應(yīng)一定時間，反應(yīng)過程用2 mol·L-1NaOH維持反應(yīng)體系的pH在8.0～8.5范圍，反應(yīng)結(jié)束后，溶液pH調(diào)至4.0，攪拌 30 min，4000 r·min-1離心 15 min，棄上清液，沉淀部分重復(fù)離心水洗2次，調(diào)pH至7.0，冷凍干燥即得普通改性產(chǎn)物。

1.2.2 超聲輔助琥珀?；男源蠖沟鞍?/p>

將大豆蛋白溶于蒸餾水中按試驗(yàn)設(shè)計(jì)配成一定濃度，取60mL于燒杯中，置于探頭式超聲處理器中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)定工作時間、間歇時間、處理功率參數(shù)，處理溫度控制在20～30℃，處理結(jié)束后，按普通琥珀?；男圆襟E執(zhí)行。

1.2.3 乳化性測定

將0.2%（W/V）的大豆蛋白樣品溶解于磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0，0.1 mol·L-1）中，取30mL溶液加入10mL大豆油，于10000 r·min-1均質(zhì)1 min，分別在均質(zhì)后的0、10 min時從底部吸取100μL樣品，用10mL，0.1%（W/V）的SDS稀釋后在500nm（OD500）下測定吸光值，乳化活性用乳化活性指數(shù)（EAI）表示，即0 min時的吸光值，乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)（ESI）表示[22]:

式中，A0-0 min時的吸光值；ΔT-時間差，10 min；ΔA-ΔT內(nèi)的吸光值差。

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析

采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[23]分析大豆蛋白改性前后的組成和結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.4.1 樣品處理

精確稱取0.01 g的樣品，溶于10mL去離子水中，在4000 r·min-1離心20 min，取上清液10μL加入10μL溶解液中，在沸水浴中加熱3 min。

1.2.4.2 灌膠和電泳過程

使用夾心式垂直板狀電泳槽，玻璃板參數(shù)為20 cm×20 cm，使用的濃縮膠濃度為4%、分離膠濃度為12%，凝膠厚度1 mm，上樣量為10μL。電泳初始時電流30ma，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠時電流增到40ma；當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠板底部時，電泳結(jié)束。

1.2.4.3 染色與脫色

剝離凝膠，加入甲醇-乙酸固定液（甲醇∶水∶乙酸=5∶5∶1，V/V）固定過夜。取出固定好的凝膠在染色液（含0.05%考馬斯亮藍(lán)R250的固定液）中染色1～2 h，棄去染色液，加入脫色液（甲醇∶冰乙酸∶水=2∶2∶9，V/V），經(jīng)常更換脫色液，直至凝膠的藍(lán)色背景褪除，蛋白條帶清晰為止。在凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中分析。

1.2.5 熒光光譜分析

樣品溶于磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol·L-1、pH 7.0）中，配制1%蛋白液，裝入1 cm石英比色皿，置于F-4500熒光分光光度計(jì)中測量，激發(fā)狹縫和發(fā)射的狹縫均為5.0nm，激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長的范圍為300～420nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助琥珀?；男源蠖沟鞍坠に噧?yōu)化

結(jié)果見表1，2。

本文在預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以乳化活性為考核指標(biāo)，應(yīng)用響應(yīng)面研究法（Response surface methodology，RSM）對影響改性產(chǎn)物EAI的大豆蛋白濃度、琥珀酸酐濃度、反應(yīng)溫度、超聲處理功率、處理時間等5個因素進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)了Boxbehnken試驗(yàn)方案，建立數(shù)學(xué)模型。Box-behnken試驗(yàn)因素水平編碼表見表1，Box-behnken試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

表1 Box-behnken試驗(yàn)因素水平編碼Table1 Factors and levels of Box-behnken experiment design

表2 Box-behnken試驗(yàn)條件及結(jié)果Table2 Box-behnken design and results of experiment

利用Design-Expert 7.1軟件對表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合分析，得到超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白的乳化活性Y的回歸方程模型為:

對Box-behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。由表3的方差分析結(jié)果可知，所得回歸方程模型極顯著（P＜0.01），并且模型的失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），說明用方程Y能夠很好擬合真實(shí)響應(yīng)面并反映出乳化活性與5個單因素之間的關(guān)系，可以利用此模型對超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白的反應(yīng)過程進(jìn)行預(yù)測和分析。根據(jù)表3的方差分析對Box-behnken模型方程進(jìn)行優(yōu)化，剔除影響不顯著項(xiàng)（P＜0.05），得到優(yōu)化后的回歸模型為:

表3 Box-behnken試驗(yàn)方差分析Table3 Variance analysis of Box-behnken design test

為了形象直觀的表示各個因素對改性產(chǎn)物乳化活性的影響，根據(jù)模型繪制出因素間響應(yīng)面圖，揭示因素間的交互作用對產(chǎn)物乳化活性的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1-a、1-b、1-c、1-d可知，大豆蛋白濃度對改性產(chǎn)物EAI的影響曲線較平緩，最佳反應(yīng)條件集中在中心區(qū)，模型分析也表明蛋白濃度對改性產(chǎn)物的EAI影響不顯著（P＞0.05）。

圖1 影響乳化活性因素的響應(yīng)面分析Fig.1 Effects of variables on EAI with response surface analysis

由圖1-a、1-e、1-f、1-g可以看出，改性產(chǎn)物的EAI隨著琥珀酸酐濃度增加而呈上升趨勢，但當(dāng)琥珀酸酐濃度超過11%時，改性產(chǎn)物的EAI增加趨勢不明顯，表明此時大豆蛋白能發(fā)生?；磻?yīng)的活性基團(tuán)已經(jīng)反應(yīng)完全，模型分析表明琥珀酸酐濃度對產(chǎn)物EAI影響極顯著（P＜0.01）；由圖1-b、圖1-e、圖1-h、圖1-i能看出，反應(yīng)溫度對產(chǎn)物EAI影響顯著（P＜0.05），反應(yīng)溫度在50℃左右，改性產(chǎn)物EAI達(dá)到最高，高于或者低于此溫度，EAI均下降；從圖1-c、圖1-f、圖1-h、圖1-j和模型方差分析中反映出，超聲處理功率對產(chǎn)物EAI的影響極顯著（P＜0.01），在600 W左右產(chǎn)物EAI達(dá)到最高值，表明超聲處理可以使大豆蛋白較緊密的結(jié)構(gòu)舒展開[23]，功率太高可能破壞已經(jīng)形成蛋白聚集體使產(chǎn)物EAI降低，而處理功率不足時，蛋白緊密的球狀結(jié)構(gòu)不能充分伸展，疏水基團(tuán)不能充分暴露，因而產(chǎn)物EAI也不高；從圖1-d、圖1-g、圖1-i、圖1-j可知，超聲處理時間對產(chǎn)物EAI的影響，當(dāng)處理時間為8 min左右時，產(chǎn)物EAI達(dá)到最高值，再繼續(xù)增加處理時間則產(chǎn)物EAI有下降趨勢。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-behnken試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢?yōu)化反應(yīng)條件，得出超聲輔助琥珀?；男源蠖沟鞍椎闹苽錀l件為:大豆蛋白濃度7.1%，琥珀酸酐濃度12%，反應(yīng)溫度51℃，超聲功率580 W，處理時間8 min，在此條件下模型EAI理論預(yù)測值（OD500）為0.825，實(shí)際測得值為0.819，實(shí)際值與預(yù)測值之間的相對誤差在±1%以內(nèi)，說明利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)可靠準(zhǔn)確，依據(jù)模型對改性產(chǎn)物EAI進(jìn)行預(yù)測在實(shí)際試驗(yàn)中具有可行性。根據(jù)優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并對比不同處理?xiàng)l件下個樣品的乳化特性，如圖2所示。

圖2 改性產(chǎn)物與未改性樣品EAI和ESI比較Fig.2 Comparison of EAI and ESI of modified and non-modified soybean proteins

結(jié)果表明，單一使用超聲波處理或琥珀?；梢允垢男援a(chǎn)物的乳化活性和穩(wěn)定性明顯提高（2號樣品和3號樣品），而超聲輔助琥珀?；男援a(chǎn)物的EAI和ESI（4號樣品）要優(yōu)于前兩種單一方法，說明4號樣品的EAI和ESI大幅提高是物理超聲波作用和琥珀酰化化協(xié)同作用的結(jié)果，其EAI和ESI比空白樣品分別提高了94.5%和268.9%，因此試驗(yàn)研究可為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)高乳化型大豆蛋白產(chǎn)品提供理論和技術(shù)參考。

2.3 SDS-PAGE電泳分析

本文對改性前后的大豆蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)超聲改性的大豆蛋白的電泳譜帶與未改性大豆蛋白的譜帶幾乎完全相同，說明超聲作用只改變了大豆蛋白的高級結(jié)構(gòu)，而對大豆蛋白的一、二級結(jié)構(gòu)無明顯影響，與Taylar等的研究結(jié)果一致[24]，因此超聲改性大豆蛋白乳化性的提高不是因?yàn)榈鞍追肿恿拷档驮斐傻?。?jīng)琥珀酰化和超聲輔助琥珀?；男源蠖沟鞍椎碾娪具w移率略小于未改性的大豆蛋白，說明琥珀酸酐基團(tuán)成功引入并使大豆蛋白分子發(fā)生了一定的聚集，從而使得大豆蛋白分子質(zhì)量增大。而在譜帶的構(gòu)成上，與未改性的大豆蛋白相比變化不大，說明在改性的過程中大豆蛋白幾乎不發(fā)生水解反應(yīng)，乳化性的提高是?；磻?yīng)引入琥珀酸酐基團(tuán)的作用。樣品3和樣品4的譜帶顏色相對較淺，一方面是由于酰化改性使得大豆蛋白溶解性提高，在離心除鹽時有少量大豆蛋白隨上清液除去，另一方面是離心未除凈的少量鹽類物質(zhì)使反應(yīng)產(chǎn)物中的蛋白含量降低。

圖3 改性前后大豆蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of modified or unmodified SP

2.4 熒光光譜分析

熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)，方法簡便等優(yōu)點(diǎn)，可用于研究溶液中的蛋白質(zhì)的構(gòu)象。在蛋白質(zhì)分子中，能發(fā)射熒光的氨基酸只有Trp、Tyr、Phe，其熒光峰位（λmax）分別是348、303及282 nm，其中Trp的熒光強(qiáng)度最大，Phe的熒光強(qiáng)度最小。蛋白質(zhì)熒光通常在280nm或更長的波長被激發(fā)，此條件下Phe基本不被激發(fā)，所以很少能觀察到Phe的熒光發(fā)射，蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來自Trp和Tyr殘基。本試驗(yàn)將改性前后的樣品進(jìn)行熒光光譜比較分析，結(jié)果見圖4。

圖4 四種大豆蛋白樣品的熒光發(fā)射圖譜Fig.4 Fluorescence emission spectrums of four soybean proteins samples

大豆蛋白經(jīng)改性后，熒光吸收強(qiáng)度均增加。Trp殘基對微環(huán)境的變化很敏感，常被作為內(nèi)源熒光探針來研究溶液狀態(tài)蛋白質(zhì)的構(gòu)象，其λmax一般在325～350nm波長范圍內(nèi)波動[25]。由圖4可知，不同改性方法對其熒光光譜影響程度有所不同，琥珀酰化和超聲輔助琥珀?；男詫Φ墓庾V的影響最大，熒光強(qiáng)度增加，說明Trp殘基所處環(huán)境疏水性發(fā)生變化，反映出蛋白分子結(jié)構(gòu)變化。天然大豆蛋白的結(jié)構(gòu)為緊密的球狀結(jié)構(gòu)，親水基團(tuán)在外，疏水基團(tuán)在內(nèi)，呈色基團(tuán)絕大部分位于分子內(nèi)部，因此λmax處于較低水平，經(jīng)過超聲處理和琥珀?；男缘拇蠖沟鞍捉Y(jié)構(gòu)伸展，使內(nèi)部的呈色基團(tuán)暴露出來，使Trp的發(fā)射波長紅移。從圖中可看出超聲改性對。λmax值的影響較小，說明試驗(yàn)條件下的超聲處理對大豆蛋白的呈色基團(tuán)所處的環(huán)境影響較小，即對疏水核心破壞較小。琥珀酰化和超聲輔助琥珀?；男詫Ζ薽ax值的影響較大，說明兩種改性方法使得大豆蛋白的結(jié)構(gòu)更加舒展，但兩種大豆蛋白熒光曲線幾近重合，說明兩種改性方法對大豆蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響及對疏水核心的破壞程度相近。

3 討論

大豆蛋白的改性研究一直是食品研究熱點(diǎn)之一，尋求技術(shù)可行、效果良好、安全性高的改性方法是本領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。超聲波技術(shù)在食品加工中用來提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，取得了令人滿意的結(jié)果，經(jīng)超聲處理的乳清蛋白，其起泡性等功能特性明顯提高[7-9]，大豆蛋白的表面性質(zhì)也有提高[21]。本文的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探頭式超聲波處理器對大豆蛋白改性效果好于槽式處理器，與已有報(bào)道相符[26]。琥珀?；男源蠖沟鞍自谔岣叩鞍兹芙庑?、乳化性等方面具有明顯效果[19-21]。但是單一的物理或化學(xué)改性，大豆蛋白的乳化特性提高幅度有限或者受到制備條件制約，將超聲技術(shù)與琥珀?；男韵嘟Y(jié)合進(jìn)一步提高改性蛋白的乳化特性是本文的研究重點(diǎn)，結(jié)果表明，采用超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白的乳化特性優(yōu)于單一方法[19-20,23]，具有較好的發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳暗难芯口厔荼砻?，?fù)合改性技術(shù)成為蛋白改性領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)，因?yàn)閺?fù)合改性具有效果明顯、安全性高、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

a.超聲輔助琥珀?；男源蠖沟鞍椎娜榛再|(zhì)優(yōu)于單一的超聲改性或琥珀酰化改性方法，說明超聲輔助琥珀酰化改性技術(shù)是超聲的物理作用和琥珀?；幕瘜W(xué)作用協(xié)同作用的結(jié)果，是提高大豆蛋白乳化性質(zhì)的有效方法。

b.SDS-PAGE電泳、熒光光譜分析結(jié)果表明，超聲輔助琥珀?；男源蠖沟鞍桩a(chǎn)物結(jié)構(gòu)發(fā)生較復(fù)雜的變化，更有利于乳化體系的形成和穩(wěn)定。

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