楊淼 劉玉玉 李淑娟

重癥感染引發(fā)的膿毒癥及多臟器功能不全仍是目前ICU患者的主要死亡原因之一［1］。脂多糖(LPS)是存在于革蘭氏陰性菌外膜的一類(lèi)物質(zhì)，是內(nèi)毒素的主要成分，實(shí)驗(yàn)研究利用LPS可復(fù)制出經(jīng)典的膿毒癥和膿毒性休克的微循環(huán)障礙模型［2］。國(guó)內(nèi)俞蕾等研究發(fā)現(xiàn)顯示，黃芪可減慢失血性休克家兔心率(HR)，降低心肌耗氧量，改善心肌血液供應(yīng)，并表明黃芪可通過(guò)改善心臟輸出功能，加速心臟收縮功能的恢復(fù)［3］。但是有關(guān)黃芪對(duì)于重癥感染及膿毒性休克的研究卻罕見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在應(yīng)用LPS復(fù)制膿毒性休克大鼠模型，并應(yīng)用黃芪注射液給予治療，觀(guān)察黃芪是否存在對(duì)抗膿毒性休克的作用，并對(duì)機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物 LPS:O55:B5購(gòu)于上海前塵生物有限公司(Sigma公司生產(chǎn)，美國(guó))，用前以0.9%氯化鈉溶液溶解為10 mg/m l;黃芪注射液由哈爾濱圣泰制藥股份有限公司(批號(hào):223020822)提供，0.8%氯化鈉溶液由北京雙鶴藥業(yè)有限公司提供(批號(hào):20080223)，抗體:FITC-標(biāo)記的抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體，F(xiàn)ITC-標(biāo)記的抗-白介素-6(IL-6)抗體，F(xiàn)ITC-標(biāo)記的小鼠IgGk同型和FITC-標(biāo)記的小鼠 IgA1同型，均購(gòu)于購(gòu)于BD biosciences Pharmingen(美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 多導(dǎo)聯(lián)生理記錄儀(Power Lab，AD Instruments Co，Mountain View，CA，USA)流式細(xì)胞儀(FACSAria，B.D.Co，USA)

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備 220～250 g的Wistar雄性大鼠30只由河北北方學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物被置于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境［溫度(24±1)℃，濕度(50±5)%，交替照明12 h，實(shí)驗(yàn)前禁食給水12 h］。動(dòng)物的處理按照河北北方學(xué)院動(dòng)物中心規(guī)定的動(dòng)物處理和倫理方針進(jìn)行［4］。

1.3.1 正常組(n=10):0 min開(kāi)始經(jīng)由股靜脈連續(xù)滴注0.9%氯化鈉溶液(10 m l/h)，并將右頸動(dòng)脈插管與多導(dǎo)聯(lián)生理記錄儀連接，記錄平均動(dòng)脈壓(MAP)、HR;20 min后經(jīng)左頸靜脈連續(xù)注射0.9%氯化鈉溶液(5 ml·kg-1·h-1)，每20分鐘動(dòng)態(tài)記錄MAP、HR至100 min。

1.3.2 模型組(n=10):0 min開(kāi)始經(jīng)由股靜脈連續(xù)滴注LPS(10 mg·kg-1·h-1)，并將右頸動(dòng)脈插管與多導(dǎo)聯(lián)生理記錄儀連接，記錄MAP、HR;20 min后經(jīng)左頸靜脈連續(xù)0.9%氯化鈉溶液(5 ml·kg-1·h-1)，每 20分鐘動(dòng)態(tài)記錄 MAP、HR至100 min［4］。

1.3.3 治療組(n=10):0 min開(kāi)始經(jīng)由股靜脈連續(xù)滴注LPS(10 mg·kg-1·h-1)，并將右頸動(dòng)脈插管與多導(dǎo)聯(lián)生理記錄儀連接，記錄MAP、HR;20 min后經(jīng)左頸靜脈連續(xù)注射黃芪注射液(5 ml·kg-1·h-1)，每20 分鐘動(dòng)態(tài)記錄 MAP、HR 至100 min。

1.4 炎性因子表達(dá)的測(cè)定 3組大鼠連續(xù)觀(guān)察結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，用肝素抗凝(20 U/ml全血)，全血離心取血漿，在50μl血漿樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中加入50μl捕獲微球，室溫避光孵育1 h后加入50μl PE標(biāo)記的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，IL-6檢測(cè)抗體，室溫避光孵育2 h，形成“三明治”夾心復(fù)合物。孵育完畢后，每管加1 ml洗滌緩沖液(BD Biosciences Pharmingen，USA)進(jìn)行洗滌。洗滌后上流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，B.D.Co，USA)檢測(cè)炎性因子平均熒光強(qiáng)度，用BD Cytometric Bead Array分析軟件進(jìn)行結(jié)果處理［5］。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)量資料以±s表示，采用F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠MAP的變化 對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MAP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);模型組LPS滴注20 min后，與對(duì)照組比較，MAP明顯下降(P＜0.05);治療組大鼠40 min MAP開(kāi)始回升，至60 min MAP顯著高于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠平均動(dòng)脈壓變化n=10，mm Hg，±s

表1 3組大鼠平均動(dòng)脈壓變化n=10，mm Hg，±s

注:1 mm Hg=0.133 kPa;與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

20 40 60 80 100對(duì)照組組別LPS注入時(shí)間(min)0 103.8±5.9 100±6 99±4 98.2±3.3 97±4 98±4模型組 96.8±3.9 54±7* 56±8* 54.2±6.4* 51±9* 48±9*治療組 99.4±2.7 56±4* 61±4* 70.9±2.0*# 74±4*# 75±4*#

2.2 3 組大鼠HR變化 對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)HR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);模型組LPS滴注20 min后，與對(duì)照組相比較HR明顯上升(P＜0.05);治療組大鼠在40 min HR開(kāi)始減慢，至60 min心率顯著低于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠HR變化n=10，次/min，±s

表2 3組大鼠HR變化n=10，次/min，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

20 40 60 80 100對(duì)照組組別LPS注入時(shí)間(min)0 338±15 325±15 340±18 331±15 345±15 321±17模型組 323±16 412±26* 442±13* 441±13* 464±26* 481±14*治療組 341±32 422±22* 401±18* 376±31*# 382±29*# 391±18*#

2.3 3 組大鼠肛溫變化 對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)體溫差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);模型組在LPS滴注40 min后，與對(duì)照組相比較，肛溫明顯上升(P＜0.05);治療組大鼠在40 min肛溫開(kāi)始明顯上升，至100 min肛溫與對(duì)照組比較顯著升高(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠肛溫變化n=10，℃，±s

表3 3組大鼠肛溫變化n=10，℃，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

20 40 60 80 100對(duì)照組 36.61±0.13 36.42±0.23 36.36±0.35 36.59±0.24組別 LPS注入時(shí)間(min)0 36.32±0.12 36.22±0.22模型組 36.82±0.25 37.15±0.54 38.34±0.57* 38.30±0.73* 38.71±0.45* 38.55±0.66*治療組 37.13±0.24 36.71±0.22 38.77±0.28 39.01±0.61* 38.75±0.76* 39.17±0.82#

2.4 3 組大鼠呼吸頻率變化比較 對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)間體溫差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);模型組在LPS滴注20 min后，與對(duì)照組比較呼吸頻率明顯上升(P＜0.05);治療組大鼠在40 min呼吸頻率開(kāi)始減慢，至60 min呼吸頻率顯著低于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 3組大鼠呼吸頻率變化n=10，℃，±s

表4 3組大鼠呼吸頻率變化n=10，℃，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

20 40 60 80 100對(duì)照組組別LPS注入時(shí)間(min)0 77±6 75±8 76±8 78±8 72±11 77±10模型組 82±5 89±8* 91±9* 97±11* 96±10* 96±10*治療組 75±7 77±8*# 85±8*# 89±9*# 89±10*# 91±11*#

2.5 3 組大鼠血漿炎性因子水平 觀(guān)察結(jié)束后模型組大鼠血漿TNF-α、IL-6的濃度顯著高于對(duì)照組，而治療組大鼠血漿TNF-α、IL-6的濃度顯著低于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表5。

表5 3組大鼠血漿炎性因子水平 n=10，ng/L，±s

表5 3組大鼠血漿炎性因子水平 n=10，ng/L，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

組別 TNF-αIL-6對(duì)照組17.7±2.6 22±5模型組 254.2±64.1* 648±183*治療組 141.2±31.9 422±22#

3 討論

本研究證明了在LPS連續(xù)滴注可以引起大鼠MAP明顯下降及HR明顯上升，從而造成膿毒性休克，上述改變與時(shí)間呈線(xiàn)性關(guān)系，并且與對(duì)照組呈顯著差異，這與文獻(xiàn)報(bào)道［4］相似。此外本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組大鼠血漿炎性因子水平較對(duì)照組明顯升高，治療組給予黃芪注射液連續(xù)注射后可以顯著地抑制LPS引起的大鼠MAP的下降，同時(shí)減慢HR;降低血漿炎性因子的水平。本實(shí)驗(yàn)證明了黃芪注射液對(duì)LPS引發(fā)的膿毒性休克具有一定的改善作用。

膿毒性休克是嚴(yán)重的膿毒癥的一種表現(xiàn)，其特征為循環(huán)系統(tǒng)的衰竭，并伴隨器官衰竭及高病死率［6，7］。由于膿毒癥引發(fā)的低血壓可以導(dǎo)致微循環(huán)灌注的下降，后者與臟器功能不全及多臟功能衰竭的發(fā)生有關(guān)［8］。而研究結(jié)果顯示TNF-α，IL-6為參與膿毒性休克發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要的促炎因子［9］，與病死率直接相關(guān)［10］。因此如何改善患者循環(huán)系統(tǒng)的功能及降低體內(nèi)炎性因子的水平一直是國(guó)內(nèi)外研究膿毒癥休克治療的熱點(diǎn)之一。盡管早在2001國(guó)際上提出對(duì)重癥膿毒癥及膿毒性休克應(yīng)進(jìn)行“早期目標(biāo)指導(dǎo)治療(EGDT)”的概念［11］，但是膿毒癥患者的病死率依然居高不下。

國(guó)內(nèi)外在利用中醫(yī)研究膿毒癥及膿毒性休克方面做出重大貢獻(xiàn)，國(guó)內(nèi)有大量研究顯示黃芪提取物對(duì)心肌存在正性肌力作用，具有提高心輸出量，抗心力衰竭，改善心肺功能，增強(qiáng)組織抗缺氧能力，清除自由基，減輕缺血再灌注損傷等功效［3，12，13］。因此本實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到經(jīng)過(guò)治療膿毒性休克大鼠循環(huán)系統(tǒng)的改善可能與黃芪上述研究結(jié)果有關(guān)。此外，Shon等［14］研究結(jié)果表明黃芪提取物可以有效抑制LPS引發(fā)人類(lèi)羊膜細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，PGE2及LTC4，這也與我們的研究結(jié)果類(lèi)似。

綜上所述，黃芪注射液可以明顯改善膿毒性休克大鼠MAP及HR，其機(jī)制之一可能與降低體內(nèi)TNF-α，IL-6等促炎因子水平有關(guān)，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

1 Cross AS，Opal SM.A new paradigm for the treatmentof sepsis:is it time to consider combination therapy.Ann Intern Med，2003:138，502-505.

2 Pernerstorfer T，Stohlawetz P，Hollenstein U，et al.Endotoxin-induced activation of the coagulation cascade in humans:effect of acetylsalicylic acid and acetaminophen.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19:2517-2523.

3 俞蕾，王志剛，馬應(yīng)忠，等.黃芪預(yù)處理對(duì)大鼠心肌再灌注損傷的保護(hù)作用.九江醫(yī)學(xué)，2002，17:4-6.

4 Cheng PY，Lee YM，Wu YS，etal.Protective effectofbaicalein againstendotoxic shock in rats in vivo and in vitro.biochemical pharmacology，2007，73:793-804.

5 Wong CK，Lam CW and Wu AK.Plasma inflammatory cytokines and chemokines in severe acute respiratory syndrome.Clin Exp Immunol，2004，95-103.

6 Sharma S，Kumar A.Septic shock，multiple organ failure，and acute respiratory distress syndrome.Current opinion in pulmonary medicine，2003，9:199-209.

7 Ferrand RA，Herman J，Elgalib A，et al.Septic shock and multi-organ failure in HIV infection-sepsis tuberculosa gravissima.International Journal of STD ＆ AIDS，2006，17:562-564.

8 于亮，段紹斌，居來(lái)提，等.黃芪注射液對(duì)兩次打擊大鼠致多器官功能障礙綜合征中心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13:967-970.

9 Abraham E.NF-kB activation.Crit Care Med，2000，28:100-104.

10 Koga K，Ogata M，Takenaka I，etal.Ketamine suppresses tumor necrosis factor-alpha activity and mortality in carrageenan-sensitized endotoxin shock model.Circ Shock，1995，44:160-168.

11 Ressler J，Muzzin A，Knoblich B，et al.Early goal-directed therapy in thetreatment of severe sepsis and septic shock.N Engl JMed，2001，345:1368-1377.

12 王巧云，李金蓮，劉永云，等.黃芪注射液對(duì)大鼠靜脈血栓形成的影響.中成藥，2003，25:499.

13 朱子陽(yáng).黃芪注射液輔助治療肺心病急性加重期的臨床觀(guān)察.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21:268.

14 Shon YH，Kim JH，Nam KS.Effect of Astragali radix extract on lipopolysaccharide-induced inflammation in human amnion.Biol Pharm Bull，2002，25:77-80.