謝娟 張靜 程艷蕊 戎小平 張曉莉 安曉燕

充足的子宮胎盤(pán)血流灌注是胎兒健康發(fā)育的前提，己有資料證實(shí)血紅素氧合酶-1(HO-1)能增加子宮胎盤(pán)的血流灌注，加速血管生成，保護(hù)胎盤(pán)組織細(xì)胞。但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)HO-1的研究多集中在成人疾病方面或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，尚未見(jiàn)到其與新生兒窒息發(fā)病相關(guān)性的研究報(bào)道。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)健康足月兒及窒息新生兒臍血中HO-1的活性，并觀察HO-1在臍血管上的表達(dá)。研究探討新生兒臍血管上HO-1的表達(dá)與窒息的關(guān)系，以期進(jìn)一步闡明HO-1與新生兒窒息發(fā)病的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制，為新生兒窒息的病因?qū)W防治開(kāi)辟新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)科2008年1月至2009年10月正常分娩或剖宮產(chǎn)的新生兒60例，健康足月適于胎齡兒15例為對(duì)照組(A組)，窒息組分為輕度窒息組(B組) 30例和重度窒息組(C組)15例。其中男35例，女25例;胎齡37～42周。新生兒窒息的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第6版兒科學(xué)(人民衛(wèi)生出版社出版)。所有新生兒均為適于胎齡兒，無(wú)宮內(nèi)感染及先天畸形。母親年齡≥24歲并≤36歲，無(wú)子宮畸形及心臟病、均無(wú)吸煙史及被動(dòng)吸煙史。妊娠期間無(wú)特殊用藥史。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與制備:新生兒娩出斷臍后，立即用一次性無(wú)菌注射器從臍帶近胎兒端抽取臍靜脈血2 ml，注入潔凈的干燥試管中，待自然凝固后，以3 000 r/min離心10 min，提取血清，分裝入EP管中，置-80℃低溫冰箱中保存，用于臍血血清HO-1活性的測(cè)定;所有病例于胎盤(pán)娩出或剖出后10 min內(nèi)，取近胎兒處臍帶約3 cm，用10%中性甲醛溶液固定，待脫水、石蠟包埋后用于HO-1免疫組化染色。

1.2.2 免疫組化測(cè)定:臍帶組織采用(SP)法進(jìn)行免疫組化染色，石蠟標(biāo)本切為5 μm厚度，每個(gè)石蠟標(biāo)本預(yù)留一張切片行HE染色。HIF-1α為兔抗人多克隆抗體(購(gòu)自武漢博士德公司)，HO-1山羊多克隆抗體(SC-1796)(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2.3 血清HO-1活性測(cè)定原理:參照王虹等［1，2］，提供的血清HO的活性測(cè)定方法進(jìn)行。其是依據(jù)血紅素經(jīng)HO-1催化降解生成膽紅素和CO的原理，進(jìn)行樣品中膽紅素生成量的測(cè)定以代表HO-1的活性。

1.2.4 結(jié)果判定:鏡下細(xì)胞胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，每組隨機(jī)選5個(gè)高倍視野進(jìn)行判斷，參照Ota等［3］組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，由兩個(gè)觀察者對(duì)切片進(jìn)行盲式閱片，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，觀察所選擇的高倍鏡視野中的陽(yáng)性染色細(xì)胞，記錄陽(yáng)性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(%)并記分。陰性:小于5%的細(xì)胞呈陽(yáng)性或無(wú)著色，記0分;弱陽(yáng)性:5%～10%的細(xì)胞呈陽(yáng)性，記1分;陽(yáng)性:11%～50%細(xì)胞呈陽(yáng)性，記2分;強(qiáng)陽(yáng)性:大于50%的細(xì)胞呈陽(yáng)性，記3分。細(xì)胞著色強(qiáng)度則以陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色(棕黃色)記分:無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)記分和細(xì)胞染色記分相加為免疫組化積分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，采用正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性分析，多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，SNK-q法進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)分析和Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臍血管上HO-1表達(dá) 窒息組均有HO-1不同程度的表達(dá)，主要定位于臍動(dòng)、靜脈血管平滑肌細(xì)胞的胞漿內(nèi)，胞核內(nèi)也有少量表達(dá)。B組［(3.2±0.7)分］和C組［(3.7±1.3)分］與A組［(2.1±0.8)分］比較HO-1表達(dá)強(qiáng)度高(P＜0.05);B組和C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖1～4。

2.2 臍血HO-1活性 B組及C組臍血HO-1活性均顯著高于A組(P＜0.01)。而C組臍血HO-1活性測(cè)定值雖然高于B組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 C組臍血管HO-1的蛋白表達(dá)(SP×100)

圖2 C組臍血管HO-1蛋白表達(dá)(SP×400)

圖3 A組臍血管HO-1蛋白表達(dá)(SP×100)

圖4 A組臍血管HO-1蛋白表達(dá)(SP×400)

表1 3組臍血中HO-1活性比較 ±s

表1 3組臍血中HO-1活性比較 ±s

注:與A組比較，*P＜0.01

組別 HO-1 F值 P值A(chǔ)組(n=15)62±5 B組(n=30) 89±8* C組(n=15) 93±8*94.539 ＜0.01

3 討論

新生兒窒息是指嬰兒出生后無(wú)自主呼吸或呼吸抑制而導(dǎo)致低氧血癥和混合性酸中毒。凡能使血氧濃度降低的任何因素都可以引起窒息，其本質(zhì)是缺氧。新生兒窒息后可并發(fā)多臟器功能損害，如腦、心、腎、肝臟等損傷，國(guó)內(nèi)發(fā)病率約為5%～10%，是引起新生兒死亡和兒童傷殘的重要原因之一［4］。HO-1是催化血紅素降解的起始酶和限速酶，已發(fā)現(xiàn)其在多種疾病中有異常表達(dá)。HO-1的內(nèi)源性適量表達(dá)可以對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，因此本研究通過(guò)觀察窒息新生兒臍血管上HO-1的表達(dá)，及對(duì)臍血HO-1活性的測(cè)定，在分子水平探討HO-1在新生兒窒息中的作用。

HO-1及其產(chǎn)物CO、膽綠素和鐵均有明確的抗氧自由基作用，已被大量研究證實(shí)［5］。血紅素氧分酶(HO)是催化血紅素降解的起始酶和限速酶，具有廣泛的生物學(xué)功能，已發(fā)現(xiàn)有3種同工酶。其中HO-1亦稱(chēng)熱應(yīng)激蛋白32(HSP32)，是誘導(dǎo)型HO，分子量約32 000，它廣泛分布于全身組織細(xì)胞的微粒體內(nèi)，在缺氧時(shí)可誘導(dǎo)其大量表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在肝缺血再灌注過(guò)程中，隨著肝組織中HO-1mRNA表達(dá)的增加，肝細(xì)胞的凋亡逐漸減少。HO-1mRNA的表達(dá)增加能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，減少缺血再灌注時(shí)的細(xì)胞損傷［6］。多數(shù)研究結(jié)果表明，HO-1僅在急性缺氧時(shí)升高，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，以至恢復(fù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在低灌注及低代謝狀態(tài)下，觀察到缺血3周時(shí)HO-1的表達(dá)增加，6周時(shí)HO-1蛋白表達(dá)最明顯，9周時(shí)逐漸下降，HO-1缺氧應(yīng)激蛋白的基因表達(dá)，使內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)被激活，發(fā)揮代償作用［7］。Lundby等［8］觀察到，在高原地區(qū)(海拔4 100 m)居住2周和8周的健康志愿者，其肌肉組織中HO-1的表達(dá)無(wú)明顯變化。在低氧條件下培養(yǎng)1～2周的人肺末梢動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，HO-1表達(dá)也無(wú)明顯變化［9］。這些結(jié)果均表明HO-1為急性應(yīng)激反應(yīng)蛋白。

本研究顯示，窒息組臍血管上HO-1表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且臍血中HO-1活性測(cè)定亦高于對(duì)照組，由此推測(cè)缺氧狀態(tài)下，HO-1蛋白及酶活性的增多，對(duì)窒息時(shí)機(jī)體起到保護(hù)作用。HO-1活性測(cè)定是通過(guò)其生成膽紅素量來(lái)間接反應(yīng)其活性的，因此推測(cè)在缺氧狀態(tài)下HO-1通過(guò)其代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)機(jī)體對(duì)缺氧耐受。這一結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及成人相關(guān)研究相類(lèi)似:內(nèi)源性HO-1過(guò)度表達(dá)在應(yīng)激情況下保護(hù)多種組織細(xì)胞，陳波等［10］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HIF-1能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)HO-1的表達(dá)，且在缺氧復(fù)氧損傷中起到顯著抗調(diào)亡作用。HO-1的代謝產(chǎn)物CO是一種新型神經(jīng)遞質(zhì)，現(xiàn)已證實(shí)有舒張血管，抑制血小板聚集作用。因此本實(shí)驗(yàn)表明HO-1與新生兒窒息發(fā)病密切相關(guān)，在缺氧情況下表達(dá)增高，其缺氧適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制可能對(duì)機(jī)體具有重要的保護(hù)作用。

1 王虹，李華強(qiáng)，潘捷.哮喘豚鼠血紅素氧合酶1的表達(dá)與調(diào)節(jié).中華結(jié)核與呼吸雜志，1999，22:605-609.

2 Yet SF，Pellacani A，Patterson C，et al.Induction of heme oxygenase-1 expression in vascular smooth muscle cell.A link to endotoxic shock.J Biol Chem，1997，272:4295-4301.

3 Ota H，Igarashi S，Sasaki M，et al.Distribution of cyclooxygenase-2 in eutopic and ectopic endo-metrium in endometriosis and adenomyosis. Hum Reprod，2001，16:561-566.

4 王翠娟.新生兒窒息的產(chǎn)科原因分析.河北醫(yī)藥，2010，32:1127.

5 Taille C，El-Benna J，Lanone S，et al.Induction of heme oxygenase-1 inhibits NAD(P)Hoxidase activity by down-regulating cy-tochrome b558 expression via the reduction of heme availability.J Biol Chem，2004，279:28681.

6 郭雅，宋經(jīng)清，肝缺血再灌注后的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡關(guān)系的臨床研究.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19:3259-3262.

7 魏愛(ài)宣，徐忠信.慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙大鼠皮層HIF-1α、HO-1表達(dá)的變化.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，4:913-914.

8 Lundby C，Pilegaard H，vanHall G，et al.Oxidative DNA damage and repair in skeletalmuscle of humans exposed to high-altitude hy-poxia. Toxicol，2003，192:229-236.

9 Yang X，Sheares KK，Davie N，et al.Hypoxic induction of cox-2 regulates proliferation ofhuman pulmonary rtery smoothmuscle cells.Am J Respir Cell Mol Biol，2002，27:688-696.

10 陳波，趙鴻，鄭景存.缺氧誘導(dǎo)因子1在人腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞低溫缺氧再?gòu)?fù)氧損傷中的抗凋亡作用.復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005，32: 687-698.