曾德貴，劉玉琴

(1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020; 2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518048)

抗結(jié)核病藥異煙肼在臨床應(yīng)用中可引起約20%的肺結(jié)核病患者出現(xiàn)肝功能變化。異煙肼進(jìn)入人體后經(jīng)酰胺酶催化，直接或間接生成肼(hydrazine)，肼可引起肝臟出現(xiàn)甘油三酯積聚、三磷酸腺苷(ATP)耗竭等毒性反應(yīng)，是異煙肼致肝損傷的重要毒性代謝產(chǎn)物。結(jié)核桿菌對異煙肼極易產(chǎn)生耐藥性，并且隨著用藥時間的延長，異煙肼血藥濃度持續(xù)升高，易致結(jié)核病患者出現(xiàn)嚴(yán)重肝損傷，因此應(yīng)在使用過程中進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測[1－2]。目前，測定異煙肼血藥濃度有許多方法[3－5]，但大都存在提取率低、操作煩瑣的問題。筆者對以前的方法作了綜合改進(jìn)，將異煙肼進(jìn)行柱前衍生化，降低其極性，增強(qiáng)其紫外吸收，旨在建立一種靈敏度高、特異性好的反相高效液相色譜法以測定血漿中異煙肼的質(zhì)量濃度。

1 儀器與試藥

LC－1型高效液相色譜儀(日本島津);TGL－16G型臺式高速離心機(jī)。異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司，批號為22409231);異煙肼片(沈陽紅旗制藥有限公司，規(guī)格為100 mg/片，批號為080615);香草醛、三氯醋酸、三乙胺、磷酸二氫鉀、甲醇均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:YWG－C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);預(yù)柱:YWG－C18柱(25 mm ×6 mm，5 μm);流動相:V(0.02 mol/L KH2PO4)∶V(CH3OH)=61∶39，每 500 mL流動相加入 70%(V/V)的 HClO40.2 mL 及 20%(V/V)的三乙胺 0.4 mL;檢測波長:340 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。在此色譜條件下，色譜峰峰形好、分離完全，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾異煙肼的測定，異煙肼衍生物保留時間為11.08 min，香草醛保留時間為8.46 min，全程測定時間約13 min，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱量異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得含異煙肼1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。移取標(biāo)準(zhǔn)貯備液5.0 mL，稀釋至10 mL，配制成500 mg/L的異煙肼標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

2.3 血漿樣品采集與預(yù)處理

抽取健康人靜脈血，經(jīng)高速(3 000 r/min)離心處理10 min后，吸取血漿，于－20℃下冷凍保存，作為空白血漿樣品備用。健康受試者單劑量口服異煙肼片300 mg后，在24 h內(nèi)分12個時間段分別抽取靜脈血5.0 mL，高速(3 000 r/min)離心10 min分離血漿，吸取血漿，于－20℃下冷凍保存，作為異煙肼血漿樣本待測。取血漿樣品0.25 mL，置1 mL離心試管中，加100 g/L的三氯醋酸50 μL和16 g/L的香草醛溶液40 μL，然后加甲醇至總體積為0.5 mL。將上述溶液置40℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻，高速(1 000 r/min)離心5 min，吸取上清液20 μL進(jìn)樣，按外標(biāo)法定量。

2.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:取空白血漿0.25 mL共6份，分別加入質(zhì)量濃度為 500 mg/L 的異煙肼標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2，0.8，2.0，4.0，8.0，12.0 μL，再分別加入100 g/L的三氯醋酸50 μL和16 g/L的香草醛溶液40 μL，加甲醇至 0.5 mL，制成質(zhì)量濃度分別為 0.2，0.8，2.0，4.0，8.0，12.0 mg/L的溶液。異煙肼血漿樣本經(jīng)預(yù)處理后，分別進(jìn)樣20 μL，測出其峰面積。將峰面積(Y)對血漿樣品的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=2.93×105X－9.30×104，r=0.999 6(n=6)。結(jié)果表明，異煙肼質(zhì)量濃度在0.2～12.0 mg/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，最低定量濃度為0.2 g/L。

精密度試驗:按標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法精密配制異煙肼低、中、高3種質(zhì)量濃度(0.8，4.0，12.0 mg/L)的溶液，依法進(jìn)樣，連續(xù)測定 5 d，由測得質(zhì)量濃度計算日間精密度，并于標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的同天測定日內(nèi)精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度 RSD分別為 2.6%，2.5%，2.4%(n=6);日間精密度 RSD 分別為 3.9% ，3.7% ，4.0%(n=5)。所得 RSD均在4.0%以內(nèi)，表明精密度符合要求，測定方法可靠。

穩(wěn)定性試驗:將含異煙肼的血漿樣品置－20℃低溫冰箱冷凍保存，30 d后測定含量。結(jié)果高、中、低3種質(zhì)量濃度的樣品含量分別為 97.56%，99.28%，98.75% ，RSD 均在 3%以內(nèi)，表明異煙肼的血漿樣品在－20℃低溫保存條件下至少30 d內(nèi)含量保持穩(wěn)定。

回收率試驗:依法操作，制備異煙肼低、中、高3種質(zhì)量濃度(0.8，4.0，12.0 mg/L)的血漿樣品，按樣品預(yù)處理方法處理后，依法進(jìn)樣測定質(zhì)量濃度，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 異煙肼的回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.5 異煙肼血漿濃度測定

10例男性健康受試者單劑量口服異煙肼片劑300 mg，分別在服藥前及服藥后的 0，0.33，0.67，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，7.00，9.00，12.00，24.00 h 經(jīng)前臂靜脈取血 3 ～5 mL，立即置涂有肝素的離心管中，在避光處靜置10～20 min，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理10 min，分離血漿，于－20℃冰箱保存待測。受試者給藥后避免劇烈運(yùn)動，試驗期間禁煙、酒和含咖啡因的飲料。測定過程中，每日建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時配制高、中、低3種質(zhì)量濃度的質(zhì)量控制樣本，每一質(zhì)量濃度做雙樣本分析，以判斷當(dāng)日結(jié)果的可靠性。按血漿樣品預(yù)處理方法處理并測定，10例受試者的平均血藥濃度－時間曲線見圖2。

圖2 10例受試者用藥后血漿平均藥物濃度－時間曲線

2.6 藥代動力學(xué)參數(shù)

將測得的濃度取均數(shù)，作為主數(shù)據(jù)通過3P97程序擬合，計算藥代動力學(xué)參數(shù)，達(dá)峰時間(tmax)和峰濃度(Cmax)采用實測值，用梯形法計算0～t藥－時曲線下面積(AUC0－t)和0－∞藥－時曲線下面積(AUC0－∞)，以半對數(shù)作圖法，由消除相末端濃度點計算半衰期(t1/2)。主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表2。

表2 異煙肼的藥代動力學(xué)參數(shù)(± s，n=10)

表2 異煙肼的藥代動力學(xué)參數(shù)(± s，n=10)

3 討論

異煙肼有快代謝型和慢代謝型，因此建立快捷、高靈敏度的異煙肼血藥濃度監(jiān)測方法很有意義。異煙肼極性大，在血漿中濃度低，所以在文獻(xiàn)[6]的基礎(chǔ)上采用異煙肼與香草醛的柱前衍生化反應(yīng)，生成弱極性化合物異煙肼－香草醛腙，使異煙肼極性降低，易溶于有機(jī)溶劑，紫外吸收增強(qiáng)，提高了檢測靈敏度和專屬性。采用V(KH2PO4)∶V(CH3OH)=61∶39的流動相時，色譜峰峰形好、分離完全。另外，結(jié)核病患者往往同時服用利福平、吡嗪酰胺等幾種抗結(jié)核病藥，因而測試易受血漿中雜質(zhì)和其他抗結(jié)核病藥的干擾。因此，還對利福平、吡嗪酰胺兩藥進(jìn)行了干擾測試，在上述色譜條件下，利福平、吡嗪酰胺在340 nm波長處無吸收，對本方法無干擾。本研究為異煙肼的血藥濃度監(jiān)測提供了一種靈敏、準(zhǔn)確、方便的實驗方法。

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