李世昌，季 瀏，馬 濤，羅 劍，李珍惜，鄭慶云

前言

骨組織的正常生長及更新有賴于骨吸收與骨形成的動態(tài)平衡。由破骨細胞作用的骨吸收是骨重建的起點，它可以清除損傷或沒有承載功能的骨組織，繼而啟動由成骨細胞作用的骨形成過程，使骨組織始終處在不斷的動態(tài)更新過程中。在某些狀態(tài)下，破骨細胞數(shù)量異常及功能紊亂，則發(fā)生骨量過分減少的疾病，如骨吸收功能亢進的骨質(zhì)疏松癥等。婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥就是由于絕經(jīng)后雌激素的迅速下降引起的破骨細胞大量生成及活化導致的。

在影響破骨細胞數(shù)量及活性的眾多因素中，骨組織及骨髓微環(huán)境中的細胞因子越來越多地受到研究者的關注，其中，骨保護素（osteop rotegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)和核因子κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB， RANK)是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族中的3個新成員，也是破骨細胞分化的調(diào)節(jié)因子，主要存在于人的骨髓及其他部分組織中。在2000年美國骨與礦物質(zhì)研究協(xié)會對它們進行了標準化命名，并統(tǒng)稱為OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)。成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞表達的 M-CSF和RANKL，在M-CSF存在的條件下，RANKL與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結合后，可促進破骨細胞的分化和激活，并抑制破骨細胞的凋亡，從而促進骨吸收。同時，成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞表達的OPG一方面，促進破骨細胞凋亡，另一方面，可與RANKL競爭性結合RANK，抑制破骨細胞生成、成熟、終止骨吸收，并通過臨近接觸的成骨細胞促進骨形成[20]。M-CSF主要由巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞產(chǎn)生，也可由成骨細胞和間充質(zhì)細胞產(chǎn)生。M-CSF一方面，可以促進骨髓造血干細胞向巨噬細胞/破骨細胞前體細胞的分化，另一方面，它通過與破骨細胞前體上的M-CSF受體結合發(fā)揮作用，促進破骨細胞的分化[10]。OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)和破骨細胞的形成與活化密切相關，研究發(fā)現(xiàn)，許多激素、細胞因子等均通過直接或間接的調(diào)節(jié)OPG、RANKL和RANK的表達來影響骨代謝[1]。

近年來，有關運動對絕經(jīng)期婦女骨骼影響的研究逐漸增多，動物和人體實驗均表明，適當?shù)倪\動可以減緩絕經(jīng)期婦女的骨質(zhì)流失，從而有效的預防骨質(zhì)疏松[7，9]。然而運動類型多種多樣，不同類型的運動產(chǎn)生的運動負荷不同，對骨的影響也不一樣。Rubin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，給6～8歲Warhill母羊后腿施加低強度、高頻（30 Hz)機械刺激（與地面垂直的振動)，每天刺激20 min，5天/周，共1年，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，接受機械刺激的羊近端股骨的骨小梁密度增加了34.2％（P＜0.01)。此外，經(jīng)未脫鈣骨的組織學檢查顯示，骨小梁體積增加了32％，骨小梁網(wǎng)格數(shù)增加了45％，網(wǎng)格間距減小了36％。這提示每個骨小梁單元的平均寬度增加，并形成了新的骨小梁。Rubin認為，生物力學干預有助于加強骨質(zhì)。Borer等[12]研究發(fā)現(xiàn)，-9°下坡運動組的運動強度雖只有45％˙VO2max，明顯低于6°上坡運動組（75％˙VO2max)，但利用足底壓力感受儀進行檢測后發(fā)現(xiàn)，-9°下坡運動組相對于6°運動組能產(chǎn)生更大的足底壓力，兩組之間有顯著差異，而且比較成骨指數(shù)（I型膠原羧基端前肽/I型膠原羧基末端肽的比值)， -9°下坡運動組與6°上坡運動組和安靜對照組之間有顯著差異。統(tǒng)計學分析顯示，成骨指數(shù)與足底壓力之間存在顯著相關性。因此，通過對比研究不同的運動方式對骨組織的影響，并以此為依據(jù)制定出科學的健骨運動方案就顯得尤為迫切。

目前，有關運動與骨健康關系的研究大多數(shù)只是停留在骨量、骨結構、骨生物力學指標以及骨代謝生化指標上，在運動對骨組織影響的細胞及分子機制研究則很少涉及，而有關運動對于破骨細胞影響的研究則更少報道。目前國內(nèi)外僅有的運動對破骨細胞影響的研究，只是通過對體外培養(yǎng)的破骨細胞施加各種力學刺激來推測運動對破骨細胞的影響[16，17]，這與真實的體育運動對體內(nèi)環(huán)境破骨細胞的影響仍有很大的差異。

本研究以去卵巢小鼠模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥狀，利用破骨細胞原代培養(yǎng)技術，研究在去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生過程中破骨細胞分化的情況，并研究在其發(fā)生過程中與破骨細胞分化密切相關的骨組織及骨髓微環(huán)境中RANKL、OPG、M-CSF和RANK等因子的基因表達的變化；同時，比較研究上、下坡跑臺運動對上述指標的影響。這對于深入揭示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及運動干預措施的選擇將具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級 C57 BL/6雌性小鼠 64只，約 8周齡，體重21.08±3.89 g（由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供)。動物購回后在本實驗中心動物房適應性喂養(yǎng)1周，然后隨機分為4組，即假手術安靜組（SHAM)，去卵巢安靜組（OVX)，去卵巢上坡跑組（OVX+UP)，去卵巢下坡跑組（OVX+DOWN)，每組16只。

1.2 主要試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)基、紅細胞裂解液、Versene、SRB染料、TCA固定液、Tris、Citrate Solution、Acid Phosphatase，Leukocyte（TRAP)Kit購自 Sigma公司；刺激因子 M-CSF和RANKL購自R＆D公司；總RNA提取試劑 Trizol購自Invitrogen；氯仿、無水乙醇、異丙醇、DEPC水、戊巴比妥鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；Agarose、Goldview染料購自 GENE company LTD；Gene ruler、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq、RNase Inhibitor購自 TaKaRa。臺式高速冷凍離心機購自KUBOTA；酶標儀購自Tecan；Leica DM 4000電子顯微鏡購自Leica；二氧化碳培養(yǎng)箱、NANODROP 2000 spectrophotometer購自 Thermo；電泳槽、電泳儀、普通PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)購自 Tanon；Applied Biosystem Step One Real-time PCR儀購自ABI；EW-6000微型離心機購自 EastWin；96孔板、12孔板、6孔板購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3 去卵巢手術

動物以1％戊巴比妥鈉（0.1 g/kg)經(jīng)腹腔麻醉后，剪除長毛，分別在脊柱兩側(cè)切開背肌1 cm切口，SHAM組小鼠行去卵巢假手術，僅去除卵巢周圍少量脂肪組織，其余3組小鼠均摘除卵巢，用可吸收的羊腸線縫合傷口，在傷口外涂少量紅霉素軟膏。

1.4 運動方案

SHAM組和OVX組在籠中正常飼養(yǎng)，沒有進行任何訓練；OVX+UP組和OVX+DOWN組于去卵巢手術后7天開始進行上坡跑或下坡跑訓練，訓練方案見表1。

表1 運動組小鼠訓練方案一覽表

1.5 破骨細胞原代培養(yǎng)及檢測

于運動組小鼠最后一次訓練結束后24 h，斷頸椎處死小鼠。取出兩側(cè)股骨、脛骨和肱骨，放入 PBS中。用剪刀剪除股骨、脛骨和肱骨兩端的關節(jié)。用2～3 mlα-MEM培養(yǎng)基、10 ml注射器和27G針頭沖洗出骨髓。將骨髓收集在50 m l離心管里，1 000 rpm離心5 min，骨髓細胞集中于離心管底部，以5 ml不完全α-MEM培養(yǎng)基懸浮細胞。加入20 m l紅細胞裂解液，上下顛倒若干次，在室溫下孵育細胞1～2 min。加入25 ml完全α-M EM培養(yǎng)基（含10％血清)，1 200 rpm離心5 min。用完全α-M EM培養(yǎng)基懸浮細胞，加入5 ng/ml的M-CSF，在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜。收集上層漂浮的骨髓干細胞（造血干細胞)，加入10 ng/m l的M-CSF，在10 cm培養(yǎng)皿中孵育2天，干細胞布滿整個培養(yǎng)皿。用 PBS沖洗細胞 2次，加入 3 mlVersene， 37℃孵育10 min，收集干細胞，用5 mlα-M EM培養(yǎng)基中和，離心后用3 m l完全培養(yǎng)基重懸細胞。把收集到的干細胞分成以下兩份分別對骨髓造血干細胞向巨噬細胞分化的能力以及巨噬細胞向破骨細胞分化的能力進行檢測。

1.將干細胞接種于96孔板，密度為每孔10 000個細胞，加入10 ng/m l的M-CSF培養(yǎng)5天，干細胞將逐漸分化為巨噬細胞（巨噬細胞在M-CSF和RANKL的作用下可繼續(xù)向破骨細胞前體分化，最終可分化為破骨細胞)，分別在第1、3、5天進行SRB染色，繪制骨髓干細胞生長曲線，以檢測骨髓干細胞生長情況。SRB染色具體步驟為：加入25 m l預冷的 TCA固定液，4℃過夜，倒掉 TCA固定液，流水沖洗5遍，風干，加入30μl SRB染料，室溫放置10 min，吸取SRB染料，用1％冰乙酸洗5遍，風干，加入100μl 10 mM的 Tris，溶解燃料，輕輕混勻，酶標儀515 nm處測OD值。

2.將干細胞接種于96孔板，密度為每孔8 000個細胞，加入10 ng/ml的M-CSF和50 ng/ml的RANKL培養(yǎng)5天，隔天換液，干細胞將依次分化為巨噬細胞、破骨細胞前體、破骨細胞，5天后進行破骨細胞 TRAP染色，以檢測破骨細胞的分化情況。破骨細胞 TRAP染色具體步驟為：配制 TRAP染色固定液和染液，吸去96孔板中的培養(yǎng)基，加入固定液，室溫固定30 s，用雙蒸水洗3次，加入染液， 37℃搖床30 min，用雙蒸水洗3次，Leica DM 4000電子顯微鏡拍照。

1.6 Real time PCR法測定骨組織 RANKL、OPG、M-CSF和RANK的基因表達

常規(guī)方法提取股骨總RNA，逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)所要檢測的目的基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢各基因引物序列，由上海生工生物技術有限公司進行引物合成，各基因引物序列及擴增長度為：

RANKL：F 5′-CTCACCTCACCATCAATGCTGC-3′， R 5′

-GAAGGGTTGGACACCTGGACGC-3′，擴增長度394 bp；

OPG：F 5′-TCCTGGCACCTACCTAAAACAGCA-3′， R 5′

-CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG-3′，擴增長度578 bp；

M-CSF：F 5′-CTGGCGAGCAGGAGTATCAC-3′，

R 5′-TCAGAGTCCTCCCAGGTCAA-3′，擴增長度606 bp；

RANK：F 5′-CTGCTCCTCTTCATCTCTGTG-3′，

R 5′-CTTCTGGAACCATCTTCTCCTC-3′，擴增長度316 bp；

β-actin：F 5′-CAATTCCATCATGAAGTGTGAC-3′，

R 5′-CCACACAGAGTACTTGCGCTC-3′，擴增長度184bp。

熒光定量 PCR擴增反應按照以下體系進行，SYBR Premix Ex Taq TM（2×)10μl、PCR Forward Primer（10 μM)0.4μl、PCR Reverse Primer（10μM)0.4μl、ROX Reference Dye（50×)0.4μl、DNA模板2μl、加 DEPC水使總反應體系達到20μl。Real time PCR分三階段，擴增采用三步法進行，溫度循環(huán)參數(shù)如下：Stage 1（1×)：95℃，1 min（預變性)。Stage 2（40×)：95℃，15 s；61℃，30s； 72℃，45 s（收集熒光)。Stage3（1×)：建立 PCR產(chǎn)物的熔解曲線，95℃，30 s；61℃，2 min；95℃，15 s；每1℃收集熒光。反應結束后，PCR儀給出各反應孔的Ct值，以β-actin基因為內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔCt計算各基因的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 實驗結果

2.1 各組小鼠骨髓干細胞生長曲線

向骨髓干細胞中加入10 ng/ml的M-CSF后，干細胞將逐漸分化為巨噬細胞，如圖1所示，在加入M-CSF后，各組小鼠骨髓干細胞向巨噬細胞分化的速度不同：當細胞培養(yǎng)至第3天時，OVX組干細胞分化數(shù)量已明顯大于SHAM組，而且具有非常顯著性差異（P＜0.01)，兩運動組干細胞分化數(shù)量明顯小于OVX組（P＜0.05)，但仍大于SHAM組（P＜0.05)，兩運動組之間的干細胞分化速度沒有顯著性差異；當細胞培養(yǎng)至第5天時，OVX組干細胞分化數(shù)量仍然明顯大于SHAM組，而且具有非常顯著性差異（P＜0.01)，兩運動組干細胞分化數(shù)量明顯小于OVX組（P＜0.01)，但仍大于 SHAM組（P＜0.01)，而兩運動組之間相比，OVX+DOWN組比OVX+UP組干細胞分化數(shù)量顯著減少（P＜0.05)。

圖1 各組小鼠骨髓干細胞生長曲線圖

2.2 不同方式跑臺運動對去卵巢小鼠破骨細胞分化的影響

圖2為破骨細胞 TRAP染色結果，從圖中可以看出，破骨細胞是一種空泡狀、類似巨噬細胞的細胞。在空泡狀的破骨細胞中顏色較深處為破骨細胞的多個細胞核聚集的部位。破骨細胞的多個細胞核聚集在一起并極化到破骨細胞的一側(cè)，而不是在中央位置，而正是由于破骨細胞的這種空泡狀和極化的結構為其發(fā)揮骨吸收的功能奠定了形態(tài)學基礎。在本研究中，向骨髓干細胞中加入10 ng/ m l的M-CSF和50 ng/m l的RANKL繼續(xù)培養(yǎng)，干細胞將依次分化為巨噬細胞、破骨細胞前體、破骨細胞。如圖2和圖3所示，在加入M-CSF和RANKL 5天后進行TRAP染色并對破骨細胞計數(shù)，結果顯示，各組小鼠骨髓干細胞向破骨細胞分化的速度明顯不同：OVX組破骨細胞數(shù)量明顯大于SHAM組（P＜0.01)；兩運動組破骨細胞數(shù)量明顯小于OVX組（P＜0.05)，但仍大于 SHAM組（P＜0. 05)；兩運動組之間相比，OVX+DOWN組破骨細胞數(shù)量明顯小于OVX+UP組（P＜0.05)。

圖2 各組小鼠破骨細胞分化的形態(tài)圖（×400倍)

圖3 各組小鼠破骨細胞分化的計數(shù)圖

2.3 OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)各因子mRNA相對表達量

OVX組與SHAM組相比較，則OVX組比SHAM組RANKL、M-CSF和RANK mRNA的相對表達量均顯著升高（P＜0.01)；而OPG mRNA的相對表達量顯著下降（P＜0.01)。兩運動組與OVX組相比較，則OVX+UP組比OVX組的RANKL mRNA相對表達量顯著性降低（P＜ 0.01)，而OPG相對表達量顯著性升高（P＜0.05)，OVX+ UP組與OVX組的M-CSF和RANK mRNA相對表達量沒有顯著性差異（P＞0.05和P＞0.05)；OVX+DOWN組比OVX組的RANKL和M-CSFmRNA相對表達量顯著性降低（P＜0.01和P＜0.05)，而OPG相對表達量顯著性升高（P＜0.01)，OVX+DOWN組與OVX組的RANK mRNA相對表達量沒有顯著性差異（P＞0.05)。兩運動組之間相比較，則OVX+DOWN組比OVX+UP組的RANKL和M-CSFmRNA的相對表達量顯著降低（P＜0.05和P＜0.05)，而 OPG mRNA的相對表達量顯著升高（P＜ 0.01)，兩運動組之間的RANK mRNA的相對表達量沒有顯著性差異（P＞0.05)（圖4)。

圖4 OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)各因子m RNA相對表達量示意圖

3 分析與討論

3.1 不同方式跑臺運動對去卵巢小鼠骨髓干細胞生長的影響

巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)主要由巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞產(chǎn)生，也可由成骨細胞和間充質(zhì)細胞產(chǎn)生，它既是破骨細胞分化早期的關鍵調(diào)節(jié)因子，也是破骨細胞增殖分化的必要條件[10]。M-CSF通過與破骨細胞前體上的M-CSF受體（c-fms)結合發(fā)揮作用。實驗發(fā)現(xiàn)，缺乏M-CSF的大鼠由于缺少破骨細胞出現(xiàn)骨骼硬化癥；而過度表達M-CSF的基因改造鼠則由于破骨細胞數(shù)目增多，出現(xiàn)嚴重的骨量減少[15]。破骨細胞來源于骨髓造血干細胞，在M-CSF和核因子κB受體活化因子配體（RANKL)等細胞因子的刺激下，造血干細胞可向巨噬細胞分化、融合并最終形成破骨細胞[19]。本研究向含有骨髓干細胞的培養(yǎng)基中加入M-CSF進行刺激，培養(yǎng)過夜后，上層漂浮的骨髓干細胞即為造血干細胞，而下層的貼壁細胞主要是骨髓基質(zhì)細胞（在某些刺激條件下可分化為成骨細胞)。對收集到的造血干細胞繼續(xù)加入M-CSF進行刺激，造血干細胞將逐漸分化為巨噬細胞（巨噬細胞在 M-CSF和RANKL的作用下可繼續(xù)向破骨細胞前體分化，最終可分化為破骨細胞)[22]。通過SRB染色，檢測造血干細胞向巨噬細胞分化的不同時段的光密度，就可以了解各組小鼠骨髓造血干細胞向巨噬細胞分化的能力，并預示著進一步向破骨細胞分化的能力。

本研究的結果顯示，OVX組骨髓造血干細胞向巨噬細胞分化的數(shù)量明顯大于SHAM組，這說明小鼠去卵巢手術后，由于雌激素的迅速下降，導致骨髓造血干細胞向巨噬細胞大量分化，這是破骨細胞大量形成和發(fā)揮骨吸收作用的前提條件，大大增加了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病幾率；而兩運動組骨髓造血干細胞向巨噬細胞分化的數(shù)量明顯小于OVX組，但仍大于SHAM組，說明跑臺運動可以有效地抑制小鼠去卵巢后骨髓造血干細胞向巨噬細胞分化的能力，對于雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥可以起到有效的預防作用，但仍不能達到正常水平；兩運動組之間相比，OVX+ DOWN組比OVX+UP組骨髓造血干細胞向巨噬細胞分化的數(shù)量明顯減少，說明在預防雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥方面，下坡跑運動比上坡跑運動更有效。

3.2 不同方式跑臺運動對去卵巢小鼠破骨細胞分化的影響

破骨細胞來源于骨髓造血干細胞，其具體分化過程為：造血干細胞在M-CSF的作用下，可分化為巨噬細胞，而巨噬細胞在M-CSF和RANKL的共同作用下可分化為破骨細胞前體并繼而分化為破骨細胞（圖5)[13]。

本研究將各組小鼠造血干細胞進行培養(yǎng)，在M-CSF和RANKL的共同刺激下，造血干細胞將逐漸分化為破骨細胞，5天后進行破骨細胞 TRAP染色，對各組破骨細胞進行計數(shù)，就可以檢測各組小鼠造血干細胞向破骨細胞分化的能力。本研究結果表明，去卵巢手術組由于雌激素的迅速下降，使骨髓造血干細胞向破骨細胞分化的能力大大增加，破骨細胞形成增多，預示著發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的危險性大大增加；而跑臺運動可以有效地抑制去卵巢手術所引起的造血干細胞向破骨細胞分化能力的增強，對雌激素缺乏引起的破骨細胞大量分化起到有效的抑制作用，大大降低了發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的危險性，且下坡跑運動的效果優(yōu)于上坡跑運動。

3.3 不同方式跑臺運動對去卵巢小鼠骨組織 OPGRANKL-RANK系統(tǒng)的影響

OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細胞分化和骨吸收功能發(fā)揮的一個重要信號通路，研究發(fā)現(xiàn)，許多激素和細胞因子都是通過影響這條通路，從而間接的參與調(diào)節(jié)骨代謝的。此外，OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)還是聯(lián)系成骨細胞與破骨細胞之間通訊的重要紐帶，成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞表達OPG和RANKL，RANKL可與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結合，從而促進破骨細胞的分化和激活，并抑制破骨細胞的凋亡；而OPG一方面，促進破骨細胞凋亡，另一方面，可與RANKL競爭性結合RANK，抑制破骨細胞分化和骨吸收，并通過臨近接觸的成骨細胞促進骨形成[18]。許多激素和細胞因子正是通過調(diào)節(jié)成骨細胞RANKL和OPG的分泌，從而參與調(diào)節(jié)破骨細胞的形成和功能發(fā)揮的。M-CSF在破骨細胞的分化和骨吸收的過程中發(fā)揮重要作用，骨髓造血干細胞向巨噬細胞/破骨細胞前體細胞的分化需有M-CSF的存在，同時， RANKL與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結合也離不開M-CSF的作用。實驗發(fā)現(xiàn)，缺乏M-CSF的大鼠由于缺少破骨細胞出現(xiàn)骨骼硬化癥；而過度表達MCSF的基因改造鼠則由于破骨細胞數(shù)目增多出現(xiàn)嚴重的骨量減少[15]。

運動訓練對于骨代謝的影響，主要是通過骨組織受到的應力、激素的分泌、運動造成營養(yǎng)吸收的改變等方面來發(fā)揮作用的，其中骨組織在運動過程中受到的應力對骨代謝的影響作用最明顯[5，23]。骨組織在運動過程中受到地面的反作用力以及骨骼肌施加的各種應力，骨細胞感受到這種應力，通過機械―化學偶聯(lián)將機械信號轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W信號來發(fā)揮作用。遍布于整個骨陷窩—骨小管網(wǎng)絡內(nèi)的骨細胞是骨的初級機械感應細胞，骨細胞通過間隙連接與骨表面細胞和臨近骨細胞保持信息聯(lián)系，他們對機械刺激的反應是加快代謝、激活基因和產(chǎn)生生長因子和基質(zhì)等[6，8]。機械信號轉(zhuǎn)化為化學信號是多個信號轉(zhuǎn)導途徑的共同結果，可導致骨細胞膜或細胞骨架水平被激活[11]，如切應力激活 G蛋白偶聯(lián)的機械刺激感受器，可引起胞內(nèi)鈣、前列腺素（Prostaglandin，PG)和一氧化氮水平的提高。一氧化氮和前列腺素 E2（Prostaglandin E2，PGE2)作為中間信號，參與將機械信號轉(zhuǎn)化為生化信號過程，引起機體多種激素和細胞因子發(fā)生變化，這些激素和細胞因子相互調(diào)節(jié)并構成一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，最終直接或間接地通過OPGRANKL-RANK系統(tǒng)調(diào)控骨代謝[3]。在 Kobayashi Y等人[14]的活體實驗中，利用正畸矯正器對大鼠上頜磨牙施加應力，結果發(fā)現(xiàn)，應力導致骨吸收向骨形成的轉(zhuǎn)換，使破骨細胞發(fā)生程序性死亡，同時原位雜交實驗顯示，在應力末端的骨表面OPGm RNA的表達增加。

本研究的結果表明，與OVX組相比，OVX+UP組比OVX組RANKL mRNA相對表達量顯著性降低，而OPG相對表達量顯著性升高；OVX+DOWN組比OVX組RANKL和M-CSFmRNA相對表達量顯著性降低，而OPG相對表達量顯著性升高。這表明，跑臺運動對骨組織起到了較好的刺激作用，骨組織在運動過程中受到了較理想的應力，通過機械—化學偶聯(lián)將機械信號轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W信號，使骨組織局部RANKL和M-CSF基因表達降低，而OPG基因表達升高，從而改善了雌激素缺乏導致的骨代謝失衡，部分阻止了骨量的下降。兩運動組之間相比較，則OVX+DOWN組比OVX+UP組RANKL和M-CSF mRNA基因的相對表達量顯著降低，而OPG基因的相對表達量顯著升高。表明在改善雌激素缺乏引起的骨代謝失衡方面，下坡跑運動比上坡跑運動的效果更顯著。另外，兩跑臺運動組與OVX組之間以及兩跑臺運動組之間的RANK基因的相對表達量均沒有顯著性差異，說明跑臺運動對骨組織RANK基因的表達沒有顯著性影響，RANK基因表達量變化可能不是一個限制因素；運動對于骨組織OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)的影響主要是通過改變OPG、RANKL和M-CSF等因子的基因表達實現(xiàn)的。

3.4 不同方式跑臺運動對去卵巢小鼠破骨細胞分化影響的對比分析

通過對比上坡跑運動與下坡跑運動對去卵巢小鼠破骨細胞分化及OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)的影響，本研究發(fā)現(xiàn)，上、下坡跑臺運動對去卵巢引起的破骨細胞的分化具有較好的抑制作用，且下坡跑運動比上坡跑運動具有更好的效果，究其原因，主要是上坡跑運動和下坡跑運動在運動時對于骨的力學刺激不同。下坡跑運動每一步跑動在下落過程中所克服的垂直方向的沖量比上坡跑運動大，其骨組織所受到的地面應力也比上坡跑運動大。此數(shù)據(jù)結果與原因分析在本實驗室前期已發(fā)表論文中已有闡述[3]，這里就不再詳細展開。另外，此結果和本實驗室前期有關縱跳運動對于骨密度影響的研究結果相吻合[2，4]。

4 結論

1.跑臺運動通過改變骨組織OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)相關因子的基因表達，可有效抑制小鼠去卵巢后破骨細胞的大量分化，從而有利于預防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

2.下坡跑運動比上坡跑運動對于小鼠去卵巢后破骨細胞分化的抑制作用更有效，這主要是由于兩種運動方式在運動中骨組織所受到的應力不同所致。

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