宋建平，謝忠禮，李 偉，李瑞琴，張 瑞，楊美鳳

肺間質(zhì)纖維化簡稱肺纖維化，是多種彌漫性肺間質(zhì)疾病的不良病理轉(zhuǎn)歸，目前西醫(yī)治療常用糖皮質(zhì)激素等，但僅對部分病人有效且極少達(dá)到長期緩解;另一方面應(yīng)用以上藥物可引起代謝紊亂、免疫抑制、繼發(fā)感染等不良反應(yīng)。近年來，中藥治療肺纖維化報(bào)道較多，已被列入中華醫(yī)學(xué)會肺纖維化防治方案中。但在以往運(yùn)用肺纖維化疾病模型進(jìn)行中藥防治實(shí)驗(yàn)研究時，很少對疾病模型不同病變階段的中醫(yī)病機(jī)進(jìn)行探討，往往從始至終使用相同的治法和方藥，未能注意體現(xiàn)“辨證論治”這一中醫(yī)特色;另一方面，從膠原代謝、細(xì)胞因子等方面研究中藥作用機(jī)制較多，而從神經(jīng)、內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)整體調(diào)節(jié)方面研究中藥作用機(jī)制較少。

我們在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)，瓜蔞薤白湯能減輕大鼠肺纖維化模型不同階段(造模后7d、28d)肺泡炎及纖維化的程度，并能影響肺組織 NE、DA、5-HT含量［1-2］。本課題通過觀察瓜蔞薤白湯對肺纖維化模型形成階段(造模后14d～28d)下丘腦、海馬NE、DA、5-HT的影響，了解肺纖維化形成階段神經(jīng)系統(tǒng)功能變化及瓜蔞薤白湯對其的干預(yù)作用，為肺纖維化中藥防治研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 普通級健康雌性Wistar大鼠，體重200g±20g，由河南省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，室溫22℃ ±2℃，相對濕度60%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，飲水量不限。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品 平陽霉素:哈爾濱博萊制藥有限公司產(chǎn)品(批號07010203)，規(guī)格:8mg/支，按3mg/kg體重給藥，使用時用生理鹽水配制成3mg/ml，按0.1ml/100g氣管內(nèi)給藥。瓜蔞薤白湯顆粒劑:三九醫(yī)藥公司產(chǎn)品，栝樓1g/袋(相當(dāng)于飲片10g，批號 0612051);薤白 1g/袋(相當(dāng)于飲片10g，批號0502151)，均購于河南中醫(yī)學(xué)院三附院。栝樓與薤白比例為2∶1，參照動物與人體的體表面積折算系數(shù)，計(jì)算動物每日用藥量為栝樓2.04g/kg體重，薤白1.02g/kg體重，用蒸餾水配制藥液后按1.5ml/100g體重灌胃給藥。

潑尼松片:浙江仙琚制藥股份有限公司，批號070608。用藥量為4mg/kg體重，用蒸餾水配制成0.267mg/ml藥液，按 1.5ml/100g 灌胃給藥。

多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品:阿法埃莎(天津)化學(xué)試劑有限公司(批號10097602)。5-羥色胺標(biāo)準(zhǔn)品:阿法埃莎(天津)化學(xué)試劑有限公司(批號10119987)。去甲腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品:阿法埃莎(天津)化學(xué)試劑有限公司(批號10131292)。正丁醇:天津化學(xué)試劑一廠(批號20070406)。濃鹽酸:洛陽昊華化學(xué)試劑廠(批號20060208)。正庚烷:天津化學(xué)試劑一廠(批號20050828)。鄰苯二甲醛:天津化學(xué)試劑一廠(批號20060403)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 F-4500熒光分光光度計(jì)，日立(HITACHI)。752N型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 動物分組

實(shí)驗(yàn)大鼠正常飼養(yǎng)3d后，按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、瓜蔞薤白湯組、潑尼松西藥對照組，每組動物12只。

2.2 造模與用藥

2.2.1 造模 本實(shí)驗(yàn)除正常組正常飼養(yǎng)不作任何處理外，模型組及用藥組按文獻(xiàn)方法造模，以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥固定位，常規(guī)消毒，行頸正中切口，鈍型分離暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端穿刺注入平陽霉素生理鹽水溶液0.1ml/100g(平陽霉素3mg/kg體重)，立即將動物直立并行旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻，縫合皮膚，待動物自然清醒后置籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2.2 用藥 從造模后第14天開始，用藥組分別灌胃藥液1.5ml/100g體重，模型組灌入等量蒸餾水。每天給藥1次，1周后復(fù)查動物體重調(diào)整給藥量，各組于造模后第28天處死。

2.3 下丘腦和海馬NE、DA、5-HT含量測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時快速斷頭取全腦，在經(jīng)冰凍處理的玻片上分離出下丘腦和海馬，置于聚丙烯管中于-80℃保存直至測定，采用熒光分光光度法檢測。操作程序見文獻(xiàn)［3］。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，雙側(cè)檢驗(yàn)，取α=0.05，對服從正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)以(珋x±s)表示，組間差異性判斷采用單因素方差分析，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Dunnett T3檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 下丘腦 NE、DA、5-HT 比較

表1顯示，各組下丘腦NE值由大到小為:潑尼松組＞模型組＞瓜蔞薤白湯組 ＞正常組，模型組與正常組、瓜蔞薤白湯組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DA值由大到小為:模型組＞潑尼松組＞瓜蔞薤白湯組＞正常組，模型組與正常組及各用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5-HT值由大到小為:模型組＞瓜蔞薤白湯組＞正常組＞潑尼松組，模型組與正常組及各用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);瓜蔞薤白湯組與潑尼松組上述指標(biāo)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 下丘腦NE、DA、5-HT比較(珋x±s)

3.2 海馬 NE、DA、5-HT 比較

表2顯示，各組海馬NE值由大到小為:潑尼松組＞模型組＞正常組 ＞瓜蔞薤白湯組，模型組與各用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DA值由大到小為:模型組＞正常組＞潑尼松組＞瓜蔞薤白湯組，模型組與各用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5-HT值由大到小為:模型組＞瓜蔞薤白湯組＞潑尼松組＞正常組，模型組與正常組及各用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);瓜蔞薤白湯組與潑尼松組上述指標(biāo)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 海馬NE、DA、5-HT比較(珋x±s)

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)互相調(diào)控，形成了一個復(fù)雜的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)。在許多疾病過程中存在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)功能的紊亂，研究神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)信息傳遞物質(zhì)在疾病過程中的變化和相互影響具有重要意義。

下丘腦是皮質(zhì)下內(nèi)臟活動中樞，調(diào)節(jié)交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)以維持機(jī)體適宜的內(nèi)環(huán)境，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中能使機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡的最重要部位。下丘腦不僅是調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要中樞，對外周的單胺能神經(jīng)系統(tǒng)也具有調(diào)節(jié)作用，是執(zhí)行神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)的高級中樞。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，對海馬下神經(jīng)元具有調(diào)節(jié)作用。下丘腦和邊緣系統(tǒng)作為神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控中心，組成神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的重要解剖基礎(chǔ)。NE、DA和5-HT是參與神經(jīng)、內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，以往對 DA、NE、5-HT與神經(jīng)、精神系統(tǒng)生理、病理關(guān)系的研究較多，近年來人們開始關(guān)注上述物質(zhì)與其他系統(tǒng)生理、病理關(guān)系的研究。如有人研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)在肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，NE能促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組下丘腦NE、DA和5-HT含量均高于正常組(P＜0.05)，提示下丘腦去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺能神經(jīng)活動在肺纖維化形成階段可能發(fā)生了變化;瓜蔞薤白湯組 NE、DA、5-HT均明顯低于模型組，提示瓜蔞薤白湯可能影響肺纖維化形成階段去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺能神經(jīng)在下丘腦的活動變化;瓜蔞薤白湯組NE、DA明顯低于潑尼松組，而 5-HT高于潑尼松組，潑尼松組DA、5-HT低于模型組，NE高于模型組但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示瓜蔞薤白湯與潑尼松對肺纖維化形成階段，去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺能神經(jīng)在下丘腦的活動變化影響不完全相同。瓜蔞薤白湯減輕肺纖維化形成階段肺部病理改變的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)下丘腦去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺能神經(jīng)活動有關(guān)。

模型組海馬組織中NE、DA的含量與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，5-HT明顯高于正常組，提示在肺纖維化形成階段，去甲腎上腺素和多巴胺能神經(jīng)在海馬的活動尚無明顯變化，而5-HT能神經(jīng)活動發(fā)生了明顯變化;瓜蔞薤白湯組NE、DA和5-HT含量均低于模型組，其中NE與DA含量并低于正常組(P＜0.05)，提示瓜蔞薤白湯對模型海馬去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺能神經(jīng)活動影響較大;瓜蔞薤白湯組NE、DA低于潑尼松組而 5-HT高于潑尼松組，潑尼松組DA、5-HT低于模型組而 NE高于模型組;提示瓜蔞薤白湯與潑尼松對肺纖維化形成階段去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺能神經(jīng)在海馬的活動變化影響不完全相同。瓜蔞薤白湯減輕肺纖維化模型形成階段肺部病理改變的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)海馬5-HT能神經(jīng)活動有關(guān)。

上述研究還表明，模型組下丘腦 NE、DA和5-HT含量均高于正常組而海馬組織中只有5-HT高于正常組，提示肺纖維化形成階段下丘腦與海馬多巴胺能神經(jīng)活動變化可能不同;瓜蔞薤白湯組與潑尼松組各組下丘腦與海馬組織中 NE、DA、5-HT含量變化趨勢基本一致，提示瓜蔞薤白湯與潑尼松各自對肺纖維化形成階段下丘腦與海馬去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺能神經(jīng)活動變化的影響基本一致。

神經(jīng)組織和各神經(jīng)系統(tǒng)之間以及神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系及各種相互調(diào)控作用。在肺纖維化病變過程中神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的變化目前報(bào)道較少。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，參與神經(jīng)、內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的 NE、DA、5-HT等物質(zhì)在肺纖維化形成階段發(fā)生了變化，但在肺纖維化的形成過程中神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)之間的相互調(diào)節(jié)作用和變化以及瓜蔞薤白湯對其的影響及意義有待于進(jìn)一步研究。

辨證論治是中醫(yī)特色。近年來，有關(guān)中醫(yī)“證”的客觀本質(zhì)研究取得不少成果，如楊勇等發(fā)現(xiàn)熱證時交感神經(jīng)興奮，腎上腺皮質(zhì)激素釋放增多，虛寒證腦、尿內(nèi)5-HT偏高，同時肺、胃、腎5-HT含量也偏高，各臟的 NE含量變化不大［5］。我們以往的實(shí)驗(yàn)表明，虛寒證模型小鼠腦組織中NE、DA含量降低，熱盛胃出血模型組血清 NE、DA、5-HT 升高［6、7］。謝輝等認(rèn)為，DA這一神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)代謝不足導(dǎo)致代謝產(chǎn)物堆積、內(nèi)環(huán)境紊亂，與中醫(yī)痰證本質(zhì)有一定的關(guān)系［8］。栝樓、薤白是中醫(yī)經(jīng)典《金匱要略》治療胸痹的主要藥物，《金匱要略》所論胸痹病機(jī)主要為陽虛陰盛、胸陽痹阻，栝樓、薤白寬胸祛痰、通陽散結(jié)，用于痰痹胸陽之證。本研究結(jié)果提示，肺纖維化形成階段下丘腦NE、DA、5-HT含量和海馬組織5-HT含量發(fā)生了變化，瓜蔞薤白湯能影響這些物質(zhì)的變化。肺纖維化模型的中醫(yī)證型歸屬及NE、DA、5-HT變化與中醫(yī)“證”的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

［1］ 宋建平，李瑞琴，李偉，等.《金匱》不同方藥對肺纖維化模型早期階段的影響(1)［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，(11):692-694.

［2］ 宋建平，劉方州，潘夢菲，等.栝蔞薤白湯對肺纖維化大鼠肺組織NE、DA、5-HT含量及 BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，(6):36-38.

［3］ 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:207-208.

［4］ 張芳杰，晏維，高嘯，等.肝炎平對肝纖維化肝組織中去甲腎上腺素和多巴胺的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2006，(2):84-86.

［5］ 梁月華，李薪萍，任 紅.寒證熱證時中樞、內(nèi)臟、尿內(nèi)兒茶酚胺及 5-羥色胺的變化［J］.中醫(yī)雜志，1991，(12):38-40.

［6］ 宋建平，孫紅光，崔姍姍，等.柏葉湯、瀉心湯對脾胃虛寒胃出血小鼠腦組織中去甲腎上腺素及多巴胺含量的影響［J］.中醫(yī)雜志，1998，(10):624.

［7］ 宋建平，等.瀉心湯、柏葉湯對熱盛胃出血模型血清 NE、DA及5-HT 的影響［J］.中國中醫(yī)藥科技，1998，(3):159.

［8］ 謝 輝，賀又舜.溫膽湯及其配伍對大鼠紋狀體DA代謝的影響［J］.湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2004，10(5):70.