王彥凱，潘利敏，王鳳麗，李林林，袁國(guó)棟，王月華

慢性腎臟病患者腎間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)的嚴(yán)重程度較腎小球病變更為重要［1］。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(renal tubular epithelial to mesenchymal transition，EMT)在 TIF發(fā)生發(fā)展中具有重 要 作 用［2］。 轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前所公認(rèn)的導(dǎo)致腎臟纖維化的重要因子，在 TGF-β誘導(dǎo)的 EMT過程中整合素連接激酶(integrin linked kinase，ILK)起重要作用。研究提示，ILK在 TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的EMT過程中扮演重要的角色，在腎間質(zhì)纖維化的病程中起重要作用［3-5］。

我們?cè)谂R床中用化瘀泄?jié)岱街委熉阅I衰竭取得了較好的療效。同時(shí)我們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，化瘀泄?jié)岱侥軌蛞种颇I小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，并能夠通過調(diào)節(jié)TGFβ1/Smad信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用［6-7］。因此，本研究進(jìn)一步探討化瘀泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠ILK的影響，為進(jìn)一步探討腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理，探討化瘀泄?jié)岱蕉嗤緩?、多靶點(diǎn)拮抗腎間質(zhì)纖維化的治療作用尋找實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用雌性、健康SD大鼠50只，體重180g±10g，清潔級(jí)，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)冀醫(yī)動(dòng)管字第703058號(hào))。

1.1.2 主要試劑 兔抗大鼠ILK多克隆抗體由美國(guó)Santa Cruz公司提供。脫氧核糖核苷三磷酸(d NTPs)、核糖核酸酶抑制劑(Rnasin)、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、無離子水、GoTaq Green Master Mix、Oligo(dT)15由美國(guó) Promega公司提供。Trizol由美國(guó)Invitrogen公司提供，溴化乙錠(EB)由美國(guó) Sigma公司提供，瓊脂糖為西班牙進(jìn)口分裝，DNA Marker由上海捷瑞生物工程有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用藥 化瘀泄?jié)岱?黃芪30g，地龍 12g，生大黃 12g，赤芍 15g，丹參 15g，槐花 15g，蒲公英15g，生牡蠣30g。由河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院藥房提供，上藥按比例稱取后水煎、過濾、濃縮，裝入瓶中密封備用。西藥對(duì)照藥:纈沙坦(批號(hào)X0538)由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型與分組 動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(簡(jiǎn)稱SHAM組)、模型組(簡(jiǎn)稱UUO組)、化瘀泄?jié)岱浇M(簡(jiǎn)稱 UUOZ組)、纈沙坦組(簡(jiǎn)稱 UUOV組)、阿魏酸哌嗪分散片組(簡(jiǎn)稱 UUOA組)，每組10只。除假手術(shù)組外其余各組均行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)［8］。手術(shù)前 1d開始給藥，化瘀泄?jié)岱浇M大鼠經(jīng)口灌服化瘀泄?jié)岱?.7g/(kg·d);阿魏酸哌嗪分散片組大鼠經(jīng)口灌服阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d);纈沙坦組大鼠經(jīng)口灌服纈沙坦5.3mg/(kg·d);假手術(shù)組和模型組灌服同等量生理鹽水，給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1d。于實(shí)驗(yàn)第21天全部殺檢，取左側(cè)腎臟去掉被膜，濾紙吸干血跡，取部分腎皮質(zhì)保存于－80℃冰箱中用于RT-PCR，部分用4%多聚甲醛固定，留作常規(guī)病理學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)觀察。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法 SABC法。半定量分析:采用HPIAS-1000型全自動(dòng)彩色病理圖像分析系統(tǒng)，在200倍光鏡下采集圖像，每例各選15個(gè)視野，計(jì)算1個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，在光亮度和放大倍數(shù)一致的條件下對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量，最后取平均值。

1.2.3 RT-PCR ILK引物:長(zhǎng)度 400 bp。上游引物:5’-GCACTCAATAGCCGTAGTG-3’，下游引物:5’-CCTACTTGTCCTGCATCTTC-3’，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5min，94℃ 50s，56℃ 60s，72℃ 1min，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃ 8min充分延伸。GAPDH:長(zhǎng)度452bp。上游引物:5’-ACCACAGTCCATGCCAT CAC-3’，下游引物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min 94℃ 45s，60℃ 60s 72℃ 1min，共 38個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 7min充分延伸。將 PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，置于凝膠圖像分析系統(tǒng) (UVP公司，美國(guó) )進(jìn)行吸光度掃描，以管家基因 GAPDH作為內(nèi)參照校正，用目的基因的吸光度與 GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。每個(gè)樣本的每個(gè)指標(biāo)重復(fù)做3次，取其均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-Way ANOVA，組間兩兩顯著性比較采用 LSD法，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 ILK蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果

ILK主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中，假手術(shù)組ILK在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)很弱。與假手術(shù)組比較，模型組和各治療組ILK的表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組相比，化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組、纈沙坦組ILK的表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中化瘀泄?jié)岱浇MILK的表達(dá)優(yōu)于阿魏酸哌嗪分散片組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其他各組間均無明顯差異(P＞0.05)(表1)。

2.2 ILK mRNA的表達(dá)及半定量分析結(jié)果

ILK RT-PCR半定量分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組和各治療組ILK的表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組、纈沙坦組ILK的表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中化瘀泄?jié)岱浇MILK的表達(dá)弱于阿魏酸哌嗪分散片組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其他各組間均無明顯差異(P＞0.05)(表 1)。

3 討論

本病屬于中醫(yī)的“虛勞”、“腰痛”、“淋證”、“關(guān)格”、“癃閉”等范疇，其病因病機(jī)有以下幾個(gè)方面:①先天異常:慢性腎衰竭的病因與患者素體虛弱、加之過勞、外邪等誘因密切相關(guān)。正虛之中尤以氣虛為主，或兼氣陰兩虛，邪實(shí)有外邪、水停、濕濁、蘊(yùn)痰、瘀血等多種。治療慢性腎衰時(shí)應(yīng)首先重視權(quán)衡標(biāo)本緩急，緩則治本，采用相應(yīng)的益氣、養(yǎng)陰、助陽(yáng)之法以扶助正氣固本。同時(shí)，“久病必瘀”，血不利則為水，瘀血阻滯，水濕郁結(jié)于內(nèi);或瘀血內(nèi)阻，氣滯血瘀?？傊?，本病是以濕熱、瘀血、絡(luò)阻、氣虛等為基本病機(jī)，且相互轉(zhuǎn)化、相互影響。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)上述病機(jī)提出以化瘀通絡(luò)、泄?jié)峤舛緸橹委煷蠓?，兼以益氣，自擬化瘀泄?jié)岱街委煴静?。方中地龍、赤芍、丹參、大黃化瘀通絡(luò)，槐花、公英清熱利濕、解毒泄?jié)幔迪犥泩?jiān)散結(jié)，黃芪益氣且有走而不守之性，不僅可以扶正固本，還可以助丹參、地龍等化瘀通絡(luò)、祛邪治標(biāo)，諸藥相伍通補(bǔ)并用，標(biāo)本兼顧。

表1 各組大鼠ILK蛋白和基因的表達(dá)(珋x±s)

腎間質(zhì)纖維化主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)的大量積聚和間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MyoF)的增生。MyoF是合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，MyoF數(shù)量與RIF的程度成正相關(guān)，被認(rèn)為是預(yù)測(cè)RIF最好的指標(biāo)。MyoF除了小部分直接由成纖維細(xì)胞活化而來以外，還有相當(dāng)一部分由腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。這一過程稱為小管上皮細(xì)胞-肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(renal tubular epithelial to mesenchymal transition，EMT)［10］，EMT在腎間質(zhì)纖維化的形成過程中起到關(guān)鍵性的作用［2］。研究 表 明，ILK參 與 了 EMT的 多 個(gè) 過程［2、11］。另有研究表明，TGF-β1 是目前所公認(rèn)的致腎纖維化重要因子，它能通過多種途徑參與 EMT，在TGF-β誘導(dǎo)的 EMT過程中 ILK起重要作用，可以阻止EMT的發(fā)生。同時(shí)有研究證實(shí)，抑制Smad信號(hào)途徑后，能抑制 TGF-β1引起的 ILK表達(dá)增多和EMT，所以 ILK可能是 TGF-β1激活的信號(hào)通路下游的一個(gè)重要因子，在EMT中發(fā)揮著重要作用。即ILK因?yàn)閰⑴c TGF-β1/Smad信號(hào)通路進(jìn)而參與EMT，是EMT過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)者，在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生中有重要作用［3、4］。

在前期研究中，我們通過觀察TGFβ1和磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)的表達(dá)，證實(shí)了化瘀泄?jié)岱侥軌蛲ㄟ^抑制腎組織 TGFβ1、p-Smad2/3蛋白的表達(dá)，從而延緩病變腎組織纖維化進(jìn)程，發(fā)揮對(duì)腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用［6、7］。本項(xiàng)研究中，我們繼以化瘀泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠進(jìn)行干預(yù)性治療，觀察了在EMT過程中起關(guān)鍵作用的TGF-β下游因子-整合素連接激酶(ILK)。結(jié)果顯示，化瘀泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠具有明確的治療和保護(hù)作用，能減輕腎臟病理?yè)p害，減少纖維化面積。我們通過用免疫組化和RT—PCR檢測(cè)ILK蛋白及其mRNA在腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化瘀泄?jié)岱綄?duì)于腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中ILK的表達(dá)具有一定的抑制作用，從而減少腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，使病變腎組織ECM合成減少，發(fā)揮對(duì)腎間質(zhì)纖維化的治療作用。

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