梁巖冰，許麗娟，王治寶

（1．張家口市食品藥品監(jiān)督管理局人事培訓(xùn)科，河北 張家口075000；2．張家口第四醫(yī)院藥劑科，河北 張家口075000；3．河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 張家口075000）

N－亞硝基化合物是目前所知的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物之一，能引起人和動物的胃、肝臟等多種器官的惡性腫瘤．亞硝酸鹽是N－亞硝基化合物的合成前體．尤其是在人和動物的胃內(nèi)，特別適于N－亞硝基化合物的合成［1］．因此清除亞硝酸鹽是阻斷致癌物的產(chǎn)生、防治癌變的有效措施之一．

蜂花粉 （bee pollen）中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、黃酮、各種活性酶、激素、維生素和礦物質(zhì)等，不僅是一種天然的完全營養(yǎng)型的滋補(bǔ)品，而且還是治療各種疾病的名貴藥材［2］．本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取油菜蜂花粉中多糖，采用超聲法制備油菜蜂花粉乙醇提取液，然后在體外模擬胃液條件下，研究油菜蜂花粉多糖和乙醇提取物清除亞硝酸鹽的作用．

1 儀器與藥品

儀器：HITACHI U－3900紫外分光光度計 （天美科技有限公司）；GOA－型電熱真空干燥箱 （天津東郊機(jī)械加工廠）；DL－720超聲波儀 （寧波江南儀器廠，45 KHz±5%）．

藥品：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品鑒定所提供，油菜蜂花粉為市場購買，于硅膠干燥器中干燥兩天后備用，其余試劑均為分析純．

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2．1 油菜蜂花粉中黃酮和多糖的含量測定

2．1．1 乙醇提取物的制備

稱取油菜蜂花粉20．00 g，以95%乙醇為溶劑微波處理30 s［3，4］．浸泡24 h后，于70℃超聲提取3次，每次25 min，料液比依次為1∶10、1∶15、1∶20，合并濾液，濾渣留待提取多糖．濾液減壓濃縮至無醇味，移至培養(yǎng)皿中烘干，稱重待用．

2．1．2 蜂花粉總黃酮的含量測定

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0．015 0 mg，置于25 ml容量瓶中，加7．5 ml無水乙醇完全溶解后，加三蒸水定容至刻度，搖勻后作為儲備液．準(zhǔn)確量取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0．25 ml，0．50 ml，0．75 ml，1．00 ml，1．25 ml，1．50 ml于6只10 ml容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉0．30 ml，搖勻，放置6 min后加入10%硝酸鋁0．30 ml，搖勻，放置6 min后加入4%氫氧化鈉4．00 ml，混勻，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置12 min后以試劑作空白，于510 nm處測其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：C＝0．1002 A＋0．0016，r＝0．999 8．結(jié)果表明在濃度為0．01 mg／ml～0．09 mg／ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得油菜蜂花粉總黃酮含量．按下式計算總黃酮得率．結(jié)果總黃酮的含量以蘆丁記為2．43%，RSD＝1．78%．

2．1．3 蜂花粉多糖的提取

利用水提醇沉法提取花粉多糖［5］．稱取上述濾渣，加8倍量蒸餾水，微沸煎煮1 h，過濾，殘渣用6倍量蒸餾水煎煮1 h．合并濾液，加無水乙醇至醇含量達(dá)80%，靜置過夜，抽濾，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，得灰白色粗多糖，于真空干燥器中干燥后稱重，待用．

2．1．4 蜂花粉多糖的含量測定

精密稱取葡萄糖對照品100．4 mg，置100 m L的容量瓶中，加水溶解定容，搖勻，即葡萄糖貯備液．精確吸取葡萄糖貯備液適量，分別加水稀釋制成0．02 mg／ml、0．04 mg／ml、0．06 mg／ml、0．08 mg／ml、0．10 mg／ml、0．12 mg／ml的溶液，搖勻．分別精確吸取上述不同濃度溶液1．0 m L，置錐形瓶中，均加10%苯酚溶液1 m L，搖勻，迅速加入濃硫酸5．0 m L，立即搖勻，室溫放置30 min，平行空白，在490 nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線．得回歸方程C＝0．0174 A＋0．0002，r＝0．9997．結(jié)果表明在濃度為0．005～0．03 mg／ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得油菜蜂花粉多糖含量．按下式計算總多糖得率．多糖含量 （%）＝C×D×100／W．結(jié)果花粉多糖含量以葡萄糖記為10．79%，RSD＝5．52%．

2．2 油菜蜂花粉乙醇提取物和花粉多糖對亞硝酸鹽清除作用的研究［6］

分別吸取油菜蜂花粉多糖貯備液或乙醇提取物貯備液0．00、1．00、3．00、5．00、7．00 ml于50．00 ml容量瓶中，加入25．00 ml p H3．0的檸檬酸鈉－鹽酸緩沖液，再加入100 mg／ml的Na NO2溶液5．00 ml，用蒸餾水定容．在體外模擬胃液，37℃下恒溫1h后吸取1．00 ml反應(yīng)液于7 cm2的培養(yǎng)皿中，加入0．4%的對氨基苯磺酸溶液2．00 ml，0．1%α－萘胺溶液2．00 ml，搖勻，放置15 min后，于525 nm處測吸光度值 （Ax），同時用蒸餾水做空白實(shí)驗(yàn) （A0），則亞硝酸鹽的清除率為：清除率＝（A0－Ax）／A0×100%．

結(jié)果表明清除率大小隨多糖和乙醇提取物的濃度變化而變化．花粉乙醇提取物加樣濃度為2．333 mg／ml時對亞硝酸鈉的清除率最大，清除率為25．37%，見圖1．花粉多糖在加樣濃度為4．317 mg／ml時對亞硝酸鈉的清除作用最大，清除率為41．70%．見圖2．

圖1 乙醇提取物對亞硝酸鈉的清除作用

圖2 多糖對亞硝酸鈉的清除作用

3 討 論

采用微波對花粉進(jìn)行破壁處理后，其內(nèi)含營養(yǎng)物質(zhì)可得以充分釋放，各種活性成分的提取分離相對容易．微波萃取具有設(shè)備簡單、適用范圍廣、萃取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省時間、節(jié)省試劑、污染小等特點(diǎn)．

亞硝酸鹽在弱酸性條件下，與氨基苯磺酸重氮化后，再與α－萘胺偶合生成紅色的化合物，用分光光度法測定亞硝酸鹽的含量．同樣條件下加入樣品液，樣品對亞硝酸鹽清除以后，再用上述方法測定剩余的亞硝酸鹽含量，進(jìn)而可計算出被清除的亞硝酸鹽的量．

結(jié)果表明壩上油菜蜂花粉多糖和乙醇提取物對亞硝酸鹽均有一定清除作用．其中多糖清除亞硝酸鹽的作用接近山楂和洋蔥提取物對亞硝酸鹽的清除作用［6，7］．

［1］ 宋茹，偉榮．微波法浸提桔皮類黃酮及其對NO2－清除作業(yè)的研究 ［J］．食品研究與開發(fā)，2007，28 （07）：25－28

［2］ 郭奕明．花粉與營養(yǎng)保健 ［J］．植物雜志，2002，（06）：39－40

［3］ 盧挺．青藏高原油菜蜂花粉酶解破壁研究 ［J］．食品科學(xué)，2002，23（03）：126－127

［4］ 楊志巖，尹樹花．油菜花粉中總黃酮的提取研究 ［J］．現(xiàn)代食品科技，2007，24（02）：164－166

［5］ 楊輝，趙媛．苯酚－硫酸法測定桃葉鴉蔥根中多糖的含量 ［J］．河北北方學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，27（05）：19－21

［6］ 趙二勞，王曉妮，張海容，等．山楂清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究 ［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（10）：29－31

［7］ 郭艷華，張玉敏．洋蔥提取物清除亞硝酸鹽的研究 ［J］．化學(xué)研究與應(yīng)用．2008，20（08）：1084－1086