趙艷明，張 強(qiáng)

Phb(2prohibitin 2，37kD)是細(xì)胞的一種結(jié)構(gòu)高度保守，分布廣泛，表達(dá)豐富的膜蛋白家族成員，同時(shí)它也是一種多功能蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞的多種生命活動(dòng)［1］，其基因cDNA序列全長(zhǎng)900個(gè)堿基對(duì)，編碼299個(gè)氨基酸殘基的phb2蛋白，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)保守的PHB結(jié)構(gòu)域(PHB domain)，一個(gè)預(yù)測(cè)的螺旋區(qū)域(coiled-coil region)［2］。研究顯示phb2參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)［3］，細(xì)胞生存［4］，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［5］，調(diào)節(jié)姐妹染色單體的結(jié)合［6］，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［1］等多種過(guò)程。為了進(jìn)一步探討人的phb2蛋白的功能，我們檢測(cè)了Phb2蛋白在HeLa細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與分布情況，對(duì)phb2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位進(jìn)行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞:HeLa細(xì)胞購(gòu)自北京生物科技發(fā)展有限公司。主要試劑:DMEM培養(yǎng)基(Gibco產(chǎn)品);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);FLAG一抗(SIGMA公司);ECL顯色試劑盒(Pierce公司);其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純或符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞以1×105～2×105/cm2的密度種入加入了DMEM的60 mm的培養(yǎng)皿(在定位實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)皿預(yù)先放入了多聚賴氨酸浸泡過(guò)的蓋玻片)37℃，5%CO2培養(yǎng)，并定期換液。

1.2.2 Western-Blot檢測(cè) 待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，收獲細(xì)胞，提取Hela細(xì)胞蛋白樣品，加入2×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min和標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker一起進(jìn)行SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%的脫脂奶粉封閉1 h，之后與FLAG一抗過(guò)夜孵育 (稀釋倍數(shù)1:500)，TBST洗膜后與二抗(山羊抗小鼠，稀釋倍數(shù)1:8000)室溫孵育1 h，TBST洗膜后于暗室加ECL試劑檢測(cè)，X線片曝光并顯影和定影。

1.2.3 熒光觀察 Hela細(xì)胞接種到經(jīng)多聚賴氨酸處理過(guò)的蓋玻片上，24 h后待細(xì)胞長(zhǎng)到20% ～30%的匯合度時(shí)。用預(yù)冷PBS溶液洗3遍。－20℃預(yù)冷的甲醇固定2 min，棄甲醇。70%乙醇洗5 min，棄乙醇，PBS溶液洗5 min，棄PBS。1%的脫脂奶粉封閉0.5 h，棄封閉液。加FLAG一抗(稀釋倍數(shù)1:200)室溫孵育2 h，回收一抗，封閉液洗3次，每次5 min。加羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(稀釋倍數(shù)1:500)室溫孵育1 h，棄二抗，用PBS溶液洗3次，每次5 min。加0.15 g/L DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，Sigma)溶液，室溫 2 min，棄DAPI溶液。用PBS溶液洗3次，每次5 min，用濾紙盡可能去除蓋玻片上的溶液，用熒光封片膠將蓋玻片封于載玻片上。4℃儲(chǔ)存過(guò)夜后用熒光顯微鏡(Olympus，BX61型)觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 phb2蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá) SDS-PAGE電泳，X線片曝光并顯影和定影，Hela細(xì)胞裂解液檢測(cè)到約37 ku大小的條帶，與phb2蛋白的分子量37 ku相符，見(jiàn)圖1。

圖1 Western-Blot檢測(cè)phb2蛋白表達(dá)

2.2 phb2蛋白在HeLa細(xì)胞的定位 見(jiàn)圖2。

3 討論

人phb2蛋白最初作為與鼠的B淋巴細(xì)胞的IgM受體相互作用蛋白而被Terashima等發(fā)現(xiàn)，因此，將其命名為BAP37(B-cell-receptor complex-associated protein)［1］。Phb2 蛋白是一種在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)并且在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的蛋白。其氨基端有一段疏水區(qū)域，該區(qū)域把phb2錨定在膜上;其余的部份位于膜間隙。羧基端含有一個(gè)所謂的PHB結(jié)構(gòu)域和一個(gè)預(yù)測(cè)的螺旋區(qū)域(coiled-coil region)，該區(qū)域在酵母細(xì)胞中參與PHB蛋白復(fù)合物的組裝［2］。

圖2 phb2蛋白在HeLa cell細(xì)胞中的定位

人的phb2位于常染色體12p13，它屬于PHB家族，家族中的另一個(gè)成員是phb1。phb2與phb1是親密的關(guān)聯(lián)蛋白并且在酵母、植物，蠕蟲、蒼蠅、哺乳動(dòng)物這些物種中是高度保守的［7］。有研究表明，phb2蛋白的氨基端有一段 MTS(mitochondrial targeting sequence)，該序列使phb2能定位在線粒體上，同時(shí)，phb2也可以借助其羧基端的結(jié)構(gòu)域使phb2定位于細(xì)胞核內(nèi)［7］。phb2定位于核內(nèi)，這與phb2具有的對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)是一致的。這種調(diào)節(jié)通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合，或是與染色質(zhì)重塑蛋白結(jié)合這種方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，如:對(duì)類固醇激素受體的調(diào)節(jié)［8］。然而使人不解的是，phb2的核定位僅在一些細(xì)胞系有報(bào)道，這些細(xì)胞系主要來(lái)自于乳腺癌和前列腺癌［9］。本研究利用進(jìn)行Western-Blot及免疫細(xì)胞熒光法等來(lái)確定phb2蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)和定位，雖然在細(xì)胞中沒(méi)有探測(cè)到phb2的核定位，但這并不能說(shuō)明phb2就不在這些細(xì)胞中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。而研究phb2蛋白在Hela細(xì)胞中的定位是研究蛋白質(zhì)功能的一個(gè)重要的方法，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的定位，可提示蛋白質(zhì)可能的功能及發(fā)揮功能的可能方式。從而為蛋白質(zhì)功能的研究提供了方向及相應(yīng)方法。

本文報(bào)道了人phb2蛋白在HeLa細(xì)胞內(nèi)主要在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，并且以核周分布為主，細(xì)胞核中未見(jiàn)到明顯的表達(dá)(圖2)，可見(jiàn)phb2蛋白在HeLa細(xì)胞內(nèi)主要在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，并且以核周分布為主，細(xì)胞核中未見(jiàn)到明顯的表達(dá)。關(guān)于phb2蛋白在HeLa細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位，還需要做大量的工作和探索。本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)人Phb2蛋白在HeLa細(xì)胞中表達(dá)和定位進(jìn)行初步的探討，對(duì)于phb2蛋白的亞細(xì)胞器定位及相應(yīng)功能，我們將在以后的工作中進(jìn)一步探討。

［1］Terashima M，Kim KM，Adachi T，et al.The IgM antigen receptor of B lymphocytes is associated with prohibitin and a prohibitin-related protein［J］.EMBO J，1994，13(16):3782 – 3792.

［2］Tatsuta T，Model K，Langer T.Formation of membrane-bound ring complexes by prohibitins in mitochondria［J］.Mol Biol Cell，2005，16(1):248–259.

［3］McClung JK，Danner DB，Stewart DA，et al.Isolation of a cDNA that hybrid selects antiproliferative mRNA from rat liver［J］.Biochem Biophys Res Commun，1989，164(3)，1316 – 1322.

［4］Jeremy A Ross，Zsuzsanna S Nagy，and Robert A Kirken.The PHB1/2 phosphocomplex is required for mitochondrial homeostasis and survival of human T cells［J］.J Biol Chem，2008，283(8):4699-4713.

［5］Sun L，Liu L，Yang XJ，et al.Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation［J］.J Cell Sci，2004，117(14):3021–3029.

［6］Takata H，Matsunaga S，Morimoto A，et al.PHB2 protects sisterchromatid cohesion in mitosis［J］.Curr Biol，2007，17(15):1356-1361.

［7］Kasashima K，Ohta E，Kagawa Y，et al.Mitochondrial functions and estrogen receptor-dependent nuclear translocation of pleiotropic human prohibitin 2［J］.J Biol Chem，2006，281(47):36401-36410.

［8］Delage-Mourroux R，Martini P G，Choi I，Kraichely，et al.Analysis of estrogen receptor interaction with a repressor of estrogen receptor activity(REA)and the regulation of estrogen receptor transcriptional activity by REA［J］.J Biol Chem，2000，275(46):35848-35856.

［9］Gamble SC，Odontiadis M，Waxman J，et al.Androgens target prohibitin to regulate proliferation of prostate cancer cells［J］.Oncogene，2004，23(17):2996-3004.