劉曉宇，郭建強(qiáng)，姚立紅，陳愛(ài)珺，付金奇，張智清

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100052

流行性感冒是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病。流感病毒根據(jù)核蛋白 (NP) 和膜蛋白(MP) 的抗原特性及其基因特性的不同分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒對(duì)人類的危害最大，常引起世界流感大流行。2009年爆發(fā)于墨西哥的甲型H1N1流感病毒是一種三元重配病毒，人類普遍易感，對(duì)人類生命健康造成了巨大的威脅。

流感病毒基質(zhì)蛋白 2 (M2) 是流感病毒表面的一種膜蛋白，雖然在病毒顆粒中含量很少，但在病毒感染細(xì)胞的表面大量存在。M2蛋白由97個(gè)氨基酸組成，天然狀態(tài)下以同源四聚體形成離子通道，在病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)起到降低病毒粒子內(nèi) pH值的關(guān)鍵性作用[1]。1918?2005年間，感染人的多種甲型流感病毒的M2蛋白胞外區(qū) (M2e) 序列沒(méi)有發(fā)生明顯變化，并且其特異性抗體能降低動(dòng)物感染流感的風(fēng)險(xiǎn)，因此M2e成為研制流感通用疫苗的重要侯選蛋白[2]。在評(píng)價(jià)M2e候選疫苗免疫后刺激的體液免疫水平時(shí)，常選用重組的或化學(xué)合成的抗原來(lái)檢測(cè)抗M2e抗體。但因?yàn)檫@些抗原與天然M2蛋白四聚體結(jié)構(gòu)不盡相同，所以檢測(cè)到的抗體在流感自然感染中并不都能與天然M2蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合[3]。有研究表明，疫苗的保護(hù)性與小鼠免疫后血清中針對(duì)真核細(xì)胞表達(dá)的 M2蛋白的特異性抗體水平相關(guān)，而與抗M2e合成肽的抗體水平不相關(guān)[4]。所以用重組 M2蛋白或化學(xué)合成的 M2e多肽評(píng)價(jià)M2e抗體的保護(hù)作用具有一定的局限性。為此，Marina等構(gòu)建了表達(dá)M2蛋白的HEK細(xì)胞系，用于評(píng)價(jià)針對(duì)天然M2蛋白的抗體水平[5]。

采用反向遺傳學(xué)技術(shù)改造流感病毒的某些重要基因使其毒力下降，再拯救病毒以制備流感減毒活疫苗是一種新的研制流感病毒疫苗的方法[6-8]。Matthew等采用類似方法用表達(dá)突變M2蛋白的293 T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞拯救流感病毒，研究M2蛋白的突變對(duì)病毒包裝及其感染性的影響[9]。運(yùn)用反向遺傳學(xué)研究 M2蛋白的功能并在此基礎(chǔ)上研發(fā)流感病毒減毒活疫苗具有廣闊的研究前景。

鑒于M2蛋白表達(dá)系統(tǒng)在研發(fā)與M2蛋白相關(guān)的流感通用疫苗中的重要作用，本研究構(gòu)建了表達(dá)M2蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。考慮到M2的離子通道功能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害，我們選用了可用四環(huán)素調(diào)控的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

含流感病毒A/PR/8/34(H1N1) 株第七節(jié)段全長(zhǎng)序列的質(zhì)粒為本室保存。pcDNA5/FRT/TO質(zhì)粒、pOG44質(zhì)粒、Flp-In T-REx-293細(xì)胞系、脂質(zhì)體(Lipofectamine) 2000、滅瘟素 (Blasticidin)、吉?dú)W霉素 (Zeocin)、潮霉素B (Hygromycin B) 和四環(huán)素均購(gòu)自Invitrogen公司。pGEM-T Easy為Promega產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ購(gòu)自NEB公司?？筂2單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 M2基因的克隆

M2基因的讀碼框中含有一段間隔區(qū)，以本室保存的含流感病毒PR8株第七節(jié)段的質(zhì)粒為模板，通過(guò)3次PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到流感病毒M2的全長(zhǎng)基因。第1次PCR反應(yīng)使用1F和1R引物擴(kuò)增包括M2基因起始密碼子在內(nèi)的26個(gè)核苷酸，第2次使用2F和2R引物擴(kuò)增包括M2基因終止密碼子在內(nèi)的268個(gè)核苷酸。第3次以前兩次PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，使用1F和2R引物擴(kuò)增全長(zhǎng)的M2基因。引物序列見(jiàn)表1。將獲得的M2基因克隆到pGEM-T Easy載體 (pGEMT-M2) 并進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.2.2 表達(dá)M2蛋白的真核表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ和 NotⅠ雙酶切質(zhì)粒pGEMT-M2，電泳回收約300 bp的基因片段，將其亞克隆至pcDNA5/FRT/TO載體的BamHⅠ和NotⅠ位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體pDFT-M2 (圖1A)，用雙酶切和PCR方法鑒定插入片段。

圖1 pDFT-M2表達(dá)載體的構(gòu)建與整合原理Fig. 1 Construction and integration principle of the expression vector pDFT-M2. (A) Construction of pDFT-M2. (B) The Flp recombinase expressed from pOG44 catalyzes a homologous recombination between the FRT sites in the host cells and the pDFT-M2. Integration of the expression construct confers Hygromycin resistance and Zeocin sensitivity to the cells.

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物的序列Table 1 Primers used in the study

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞

用含10%胎牛清 (Fetal Borine Serum，F(xiàn)BS) 改良 Eagle培養(yǎng)基 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，無(wú)抗生素) 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)FlpInTR-293細(xì)胞，細(xì)胞濃度約為2×105/孔。次日，待細(xì)胞80%成片時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的pDFT-M2與pOG44質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將3 μL 脂質(zhì)體2000與47 μL opti-MEM培養(yǎng)液混合，在另一管中將0.2 μg pDFT-M2和1.8 μg pOG44與43 μL opti-MEM 混合，然后將后者緩慢地逐滴加入前者中，輕輕混勻，室溫孵育20 min。將細(xì)胞洗2遍后加入400 μL opti-MEM，然后將100 μL混合物緩緩滴入。同時(shí)共轉(zhuǎn)染 pcDNA5/FRT/TO空質(zhì)粒與pOG44質(zhì)粒到FlpInTR-293細(xì)胞作為陰性對(duì)照。細(xì)胞在37 ℃ CO2孵箱中培養(yǎng)6~10 h后，換含2% FBS的 DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞1∶10傳代，待細(xì)胞貼壁后換含 10% FBS、15 μg/mL滅瘟素(Blasticidin) 和150 μg/mL潮霉素B (Hygromycin B)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，篩選出抗Hygromycin B的細(xì)胞 (共轉(zhuǎn)染及整合原理見(jiàn)圖 1B)。再用無(wú)限稀釋法，篩選抗Hygromycin B的細(xì)胞克隆。

1.2.4 四環(huán)素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)M2蛋白

將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)至 60%~70%成片時(shí)，在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 μg/mL的四環(huán)素誘導(dǎo)M2蛋白表達(dá)，以不加四環(huán)素的相同細(xì)胞培養(yǎng)作為對(duì)照。誘導(dǎo)48 h后，用預(yù)冷的甲醇固定細(xì)胞，以抗M2單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，作間接免疫熒光測(cè)定 (Indirect immunofluorescence assay，IFA) 檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.5 PCR檢測(cè)目的基因定點(diǎn)整合到細(xì)胞染色體

從 5×105的細(xì)胞中提取基因組 DNA。用pcDNA5/FRT/TO質(zhì)粒中插入片段兩側(cè)的序列 CMV Forward和BGH Reverse為引物，采用PCR方法，分別從轉(zhuǎn)染空載體或pDFT-M2的FlpInTR-293細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增目的片段。這對(duì)引物從轉(zhuǎn)入空載體的對(duì)照細(xì)胞基因組中應(yīng)擴(kuò)增出338 bp的序列。而轉(zhuǎn)染 pDFT-M2的細(xì)胞由于在限制性酶切位點(diǎn)BamHⅠ和NotⅠ之間插入了M2基因，所以其擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度應(yīng)為585 bp。

1.2.6 重組子定點(diǎn)整合的鑒定

將所篩選的細(xì)胞株培養(yǎng)成片后換成含100 μg/mL吉?dú)W霉素 (Zeocin) 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 3 d，用不含Zeocin的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)同一細(xì)胞作為對(duì)照，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)以評(píng)價(jià)其對(duì)Zeocin的敏感性。

1.2.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞穩(wěn)定性的鑒定

將篩選出的表達(dá) M2蛋白的細(xì)胞株分別在含有或不含有Hygromycin B的培養(yǎng)基中連續(xù)傳10代，期間監(jiān)測(cè)目的蛋白表達(dá)，以判斷轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 M2基因的克隆和真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建

以含流感病毒PR8株第七節(jié)段的質(zhì)粒為模板，經(jīng)過(guò)3次PCR擴(kuò)增得到大小約為317 bp的兩側(cè)增加了酶切位點(diǎn)的M2基因 (圖2)。將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T Easy載體，獲得重組質(zhì)粒。經(jīng)DNA測(cè)序鑒定證實(shí)插入序列正確。將該質(zhì)粒用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后電泳回收目的片段，連接到 pcDNA5/ FRT/TO載體上，得到重組表達(dá)載體 pDFT-M2。后者經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，得到大小為5 087 bp和307 bp的兩條片段，其大小與預(yù)期相符 (圖3)，說(shuō)明成功構(gòu)建了M2的真核表達(dá)載體。

圖2 PCR擴(kuò)增M2基因Fig. 2 Isolation of M2 gene by PCR. 1: PCR product of M2 gene; M: DNA marker DL2000.

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig. 3 Identification of recombinant pDFT-M2 by enzyme digestion. M1: DNA marker DL15000; M2: DNA marker DL2000; 1: pcDNA5/FRT/TO digested with BamHⅠand NotⅠ; 2: pDFT-M2 digested with BamHⅠand NotⅠ.

2.2 M2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及間接免疫熒光分析

將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pDFT-M2與pOG44質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染FlpInTR-293細(xì)胞，通過(guò)在含Hygromycin B的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出定點(diǎn)整合了外源基因的重組細(xì)胞株[10-11]。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入四環(huán)素誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，48 h后用抗M2單克隆抗體作IFA檢測(cè)。結(jié)果顯示，M2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可見(jiàn)強(qiáng)的特異性黃綠色熒光，而對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)特異性熒光。未加四環(huán)素誘導(dǎo)的重組細(xì)胞株沒(méi)有觀察到特異性熒光，說(shuō)明四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)嚴(yán)格控制著目的基因的表達(dá)[12](圖4)。本輪共篩選到16株高表達(dá)M2蛋白的細(xì)胞株。

2.3 M2基因整合到細(xì)胞基因組的鑒定

分別以轉(zhuǎn)染空 pcDNA5/FRT/TO 質(zhì)?；騪DFT-M2的293細(xì)胞基因組DNA為模板，以質(zhì)粒中插入片段兩側(cè)的序列為引物擴(kuò)增，結(jié)果前者得到338 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，后者得到585 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，表明插入 M2基因的表達(dá)質(zhì)粒整合到宿主細(xì)胞的基因組中 (圖5)。

圖4 Flp-In-T-REx-293細(xì)胞表達(dá)M2免疫熒光圖(200×)Fig. 4 Detection of M2 protein expressed in Flp-In-T-REx-293 cells with IFA (200×). pDFT-M2 transfected Flp-In-T-REx-293 cells. (A) With tetracycline induction. (B) Without tetracycline induction. (C) Negative control cells inducted with tetracycline.

圖5 PCR鑒定M2基因整合到細(xì)胞基因組Fig. 5 Identification of pDFT-M2 integrating into cell genome by PCR. M1: DNA marker DL2000; 1: Genome DNA from cells transfected with pcDNA5/FRT/TO; 2: Genome DNA from cells transfected with pDFT-M2.

圖6 篩選出的細(xì)胞株對(duì)吉?dú)W霉素敏感性實(shí)驗(yàn) (200×)Fig. 6 Detection of Zeocin sensitivity of 293 cells transfected with pDFT-M2. (A) Without Zeocin in cell culture media. (B) With Zeocin in cell culture media.

2.4 重組子定點(diǎn)整合的鑒定

FlpInTR-293細(xì)胞本身具有對(duì) Zeocin的抗性。重組表達(dá)載體與pOG44共轉(zhuǎn)染后會(huì)使前者整合到細(xì)胞基因組FRT位點(diǎn)，使細(xì)胞失去對(duì)Zeocin的抗性，即轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株應(yīng)對(duì)Zeocin敏感。我們將所篩選出的細(xì)胞株分別在含有或不含有Zeocin的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，在含有Zeocin培養(yǎng)基中的細(xì)胞停止生長(zhǎng)并逐漸壞死，而對(duì)照組細(xì)胞正常生長(zhǎng)(圖6)。這一結(jié)果進(jìn)一步證明重組子定點(diǎn)整合在細(xì)胞基因組的FRT位點(diǎn)。

2.5 重組細(xì)胞株的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將篩選的細(xì)胞株在含Hygromycin B的培養(yǎng)基中連續(xù)傳10代，每代細(xì)胞用四環(huán)素誘導(dǎo)后作免疫熒光檢測(cè)，可以看到細(xì)胞仍能高效表達(dá) M2蛋白，且表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，說(shuō)明我們構(gòu)建的細(xì)胞系穩(wěn)定性很好，第5代和第 10代細(xì)胞 IFA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7A、B。即使將細(xì)胞株在未加Hygromycin B的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，同樣也能高效表達(dá)M2蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖7C，說(shuō)明該細(xì)胞株非常穩(wěn)定。

圖7 篩選的細(xì)胞連續(xù)傳代后表達(dá)M2蛋白的免疫熒光圖(200×)Fig. 7 Detection of M2 protein expressed in the transfected 293 cells with IFA after serial passaging. (A) The fifth passage. (B) The tenth passage. (C) The tenth passage without Hygromycin B.

3 討論

M2 蛋白具有離子通道活性，在細(xì)胞膜上表達(dá)會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)外離子濃度平衡，造成對(duì)細(xì)胞的毒性作用，因而不利于建立持續(xù)表達(dá) M2蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系[13-14]。為了構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) M2蛋白的細(xì)胞系，避免它可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損害，本課題選用了四環(huán)素誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。pcDNA5/FRT/TO是一種含有巨細(xì)胞病毒 (CMV) 啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，該啟動(dòng)子后面插入了四環(huán)素操縱子序列 TetO2。此質(zhì)粒還含有 Flp重組酶結(jié)合位點(diǎn)(FRT) 和 Hygromycin B抗性基因。與其匹配的Flp-In T-Rex-293細(xì)胞系染色體上也含有一個(gè)FRT位點(diǎn)，并表達(dá)能與TetO2結(jié)合的四環(huán)素抑制子。將構(gòu)建的含有M2基因的真核表達(dá)載體pDFT-M2與pOG44質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染FlpInTR-293細(xì)胞時(shí)，pOG44編碼的Flp重組酶介導(dǎo)pDFT-M2質(zhì)粒在宿主細(xì)胞染色體的FRT位點(diǎn)發(fā)生同源重組[15](圖1B)。這種定點(diǎn)整合使Hygromycin B抗性基因插入到了細(xì)胞SV40啟動(dòng)子和ATG起始密碼子下游，從而使Hygromycin B抗性基因表達(dá)，因此可通過(guò)這種新增加的抗性篩選定點(diǎn)整合的細(xì)胞。CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因表達(dá)依賴于四環(huán)素存在與否。不存在四環(huán)素時(shí)，F(xiàn)lpInTR-293細(xì)胞表達(dá)的四環(huán)素抑制子與TetO2結(jié)合，抑制目的基因轉(zhuǎn)錄；存在時(shí)，四環(huán)素與TetR結(jié)合使其脫離TetO2，解除抑制，從而使目的基因順利表達(dá)。

本研究從篩選得到的細(xì)胞株基因組 DNA中擴(kuò)增出插入的目的片段，表明pDFT-M2重組質(zhì)粒整合到FlpInTR-293細(xì)胞基因組中 (圖5)。圖1B示意的整合原理顯示表達(dá)載體在細(xì)胞基因組FRT位點(diǎn)準(zhǔn)確插入使得lacZ-Zeocin基因與其上游SV40啟動(dòng)子和ATG隔離，因而Zeocin抗性基因不能表達(dá)，使本來(lái)具有Zeocin抗性的細(xì)胞變?yōu)閷?duì)Zeocin敏感。細(xì)胞對(duì)Zeocin敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以間接證明表達(dá)質(zhì)粒整合到了宿主細(xì)胞基因組FRT位點(diǎn) (圖6)。這種通過(guò)定點(diǎn)整合構(gòu)建的細(xì)胞系不僅表達(dá)水平高，而且非常穩(wěn)定。從圖7可以看到細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)10代仍能高效表達(dá)M2蛋白。這樣穩(wěn)定表達(dá)M2蛋白的細(xì)胞系完全可以滿足今后研究的需要。

M2蛋白對(duì)細(xì)胞可能具有毒性，所以我們選用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)以避免持續(xù)表達(dá) M2蛋白對(duì)細(xì)胞造成的損傷。圖4顯示未加四環(huán)素時(shí)M2蛋白幾乎無(wú)表達(dá)，說(shuō)明四環(huán)素嚴(yán)格地控制著目的基因的表達(dá)。這也能解釋為什么細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng) 10代仍然正常分裂、生長(zhǎng)，而未見(jiàn)細(xì)胞活力下降或細(xì)胞壞死。

本研究成功構(gòu)建了四環(huán)素調(diào)控表達(dá) M2蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，并篩選出16株高表達(dá)的細(xì)胞株。M2的表達(dá)嚴(yán)格受四環(huán)素的調(diào)控，在多次傳代后仍能穩(wěn)定表達(dá)，這為今后評(píng)價(jià) M2通用疫苗在體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的保護(hù)性提供了新的平臺(tái)，并為應(yīng)用反向遺傳學(xué)方法研究流感減毒活疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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