王楠,劉 斌*,楊東輝,王 冠,史永鋒,張基昌,武軍鐸,張 濤

（1.吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院心血管內(nèi)科,吉林長(zhǎng)春 130041;2.吉林省電力醫(yī)院）

代謝綜合征（Metabolic Syndrome,MS）是以中心性肥胖、糖尿病或糖調(diào)節(jié)受損、高血壓、血脂異常以及胰島素抵抗（insulin resistance,IR）為共同病理生理基礎(chǔ),以多種代謝性疾病合并出現(xiàn)為臨床特點(diǎn)的一組臨床癥候群。越來越多的研究表明MS是缺血性心臟病的主要危險(xiǎn)因素之一。AryaMani[1]于2007年發(fā)現(xiàn)在具有早發(fā)MS及冠心病特征伊朗一家族中LRP6基因第1973位堿基由C突變?yōu)門,引起了半胱氨酸（Cys C）替代了精氨酸（Arg R）,而第1973位堿基組成的密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸為第611位氨基酸,當(dāng)?shù)?973位堿基為C時(shí)它所表達(dá)的氨基酸為精氨酸（Arg R）,而該為堿基為T時(shí),它所表達(dá)的氨基酸為半胱氨酸（Cys C）,即LRP6基因Arg611Cys簡(jiǎn)稱LRP6基因R611C。在此家族中有該基因突變的患者有高血壓、高血脂和糖尿病,并且他們有非常高的發(fā)生心臟病的風(fēng)險(xiǎn)。該家族一個(gè)重要的特征是,有基因突變的成員表現(xiàn)MS和早期冠心病,但無基因突變的成員則是正常的。本研究探討我國(guó)吉林地區(qū)漢族MS與LRP6基因R611C基因多態(tài)性的有無相關(guān)性。

1 實(shí)驗(yàn)方法

2008年8月-2010年2月吉林大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科患者均來自吉林省地區(qū)漢族人群194例。入院后身高、體重、腰圍、血壓,并空腹12小時(shí)采靜脈血由我院化驗(yàn)科生化室檢測(cè)空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇。分為（1）MS組（MS）（n=98）其中MS組包含血糖升高患者（＞5.6 mmol/L）（n1=58）、高血壓（BP＞140/90mmHg）患者（n2=66）、高脂血癥（n3=62）。（2）對(duì)照組（n=96）:其中血糖＜5.6mmol/L（n1=66）、血壓正常（n2=68）、血脂正常（n3=65）。

從基因文庫(kù)中調(diào)取的LRP6第1955位至2166位mRNA基因序列全長(zhǎng)共211 bp即為PCR目的基因片段（詳見下圖）（genemap序號(hào):gi|148727287|ref|NM002336.2|Homo sapiens LRP6）,mRNA）

ATAGACCTCAGGGCCTTCGCTGTGCTTGCCCTATTGGCTTTGAACTCATCAGTGACATGAAGACCTGCATTGTCCCAGAGGCTTTCCTTTTGTTTTCACGGAGAGCAGATATCAGACGAATTTCTCTGGAAACAAACAATAATAATGTGGCTATTCCACTCACTGGTGTCAAAGAAGCTTCTGCTTT GGATTTTGATGTGACAGACAACCG應(yīng)用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。（注:第1975位、1976位堿基為CT,在不影響PCR產(chǎn)物和酶切位點(diǎn)的情況下,為使CSP45Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切,在設(shè)計(jì)上游引物時(shí)將第1975位、1976位堿基設(shè)計(jì)為AA,形成CSP45Ⅰ限制性內(nèi)切酶的回文序列TT*CGAA）

上游引物:5'-ATAGACCTCAGGGCCTTCGAAGTGCTTGC-3',

下游引物:5'-GGATTTTGATGTGACAGACAACCG-3'

2.2.4 CSP45Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn):（TT*CGAA）

5'… TTCGAA…3',

3'… AAGC TT…5'

2 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示,計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示,基因型和等位基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算單個(gè)基因型,組間等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)和R×C列聯(lián)表 χ2檢驗(yàn),P＜0.05為有顯著性差異;通過病例對(duì)照研究,運(yùn)用logistic回歸分析的方法,驗(yàn)證各組基因型和對(duì)照組基因型之間的關(guān)系計(jì)算出比值比（odds ratio,OR）及95%可信區(qū)限（confidence intervals,CI）,以O(shè)R的95%CI不包含1為具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 MS組和對(duì)照組臨床資料及生化指標(biāo)比較

MS組和對(duì)照組在年齡上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）,MS組與對(duì)照組在體重指數(shù)（BMI）、腰圍、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、血糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHO）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）上均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

3.2 所得PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶CSP45I進(jìn)行特定序列的酶切有三種電泳結(jié)果見圖1中2、3、4道。

3.2.1 當(dāng)?shù)?973位堿基C突變?yōu)門時(shí)則酶切后電泳應(yīng)出現(xiàn)一條211 bp電泳條帶,此時(shí)基因型為CC型（圖1中2道）。

3.2.2 當(dāng)?shù)?973位堿基C不發(fā)生突變?yōu)門時(shí)則酶切后電泳應(yīng)出現(xiàn)兩條條帶即194 bp與17 bp,由于17 bp的電泳帶與194 bp差距較大且Marker最小為200 bp,故17 bp電泳條帶觀察不到,只觀察到一條194 bp條帶,此時(shí)基因型為純合子RR型（圖1中3道）。

表1 兩組臨床資料及生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

圖1 PCR擴(kuò)增及CSP45I酶切后電泳圖

3.2.3 若酶切后電泳出現(xiàn)兩條條帶分別為211 bp與194 bp,17 bp電泳條帶觀察不到,211 bp條及194 bp條帶均較暗,則此時(shí)基因型為雜合子RC型（圖1中4道）。

3.3 各組LRP6基因R611C基因頻率表

表2 MS組和對(duì)照組LRP 6基因R 6 1 1 C基因頻率表

表3 血糖升高患者與血糖正?；颊週RP6基因R611C基因頻率表

表4 高血壓患者與血壓正?；颊週RP6基因R611C基因頻率表

表5 肥胖組和對(duì)照組LRP6基因R611C基因頻率表

表2、表3、表4、表5結(jié)果分析表明LRP6基因 R611C 基因多態(tài)性與MS、血糖升高、血壓升高、肥胖均無相關(guān)性。

表6 高脂血癥患者與血脂正?；颊週RP6基因R611C基因頻率表

4 討論

代謝綜合征是一組由遺傳因素與環(huán)境因素共同決定的臨床癥候群,包括葡萄糖與胰島素代謝異常、肥胖（特別是腹型肥胖）、高脂血癥與高血壓。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（low density lipoprotein receptor related protein6,LRP6）是 1998年被克隆出來的單跨膜受體[2,3],是LRP家族成員之一,LRP6基因近年來成為研究熱點(diǎn)之一,LRP6基因在人和小鼠之間具有極高的同源性,并且在果蠅中也存在對(duì)應(yīng)的同源基因:Arrow[4,5]。人的LRP6基因在染色體上的位置為12p11-p13,mRNA為9 kb,相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)為 1613個(gè)氨基酸,具有信號(hào)肽和跨膜區(qū),是I型單跨膜蛋白質(zhì)。Arya Mani[1]于2007年發(fā)現(xiàn)在具有早發(fā)MS及冠心病特征伊朗一家族中LRP6基因第1973位堿基由C突變?yōu)門,引起了半胱氨酸（Cys C）替代了精氨酸（Arg R）。伊朗及美國(guó)大樣本MS人群研究并沒有發(fā)現(xiàn)這一基因突變。2008年日本學(xué)者Yukio[6]在對(duì)日本2型糖尿病患者研究中亦未發(fā)現(xiàn)與LRP6基因R611C基因多態(tài)性有相關(guān)性。本研究結(jié)果表明LRP6基因R611C與吉林漢族地區(qū)MS的發(fā)生無相關(guān)性,考慮LRP6基因R611C與MS相關(guān)可能只存在特殊遺傳家族中,也可能是LRP6基因R611C與MS的某一表型如血糖升高、高血脂、高血壓、肥胖等有關(guān)。有研究表明在小鼠中TCF7L2基因（也稱TCF4）是調(diào)節(jié)胰高血糖素樣肽-1分泌,與β-catenin共同作為 Wnt信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[7]。LRP6、TCF7L2的過度表達(dá)可以標(biāo)記的肥胖鼠模型中增加高胰島素血癥和胰島素抵抗從而使胰島素的敏感性增加和脂肪細(xì)胞的減少,并最終導(dǎo)致血糖穩(wěn)定的提升。但本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)LRP6基因R611C與血糖升高相關(guān)。LRP6參與清除細(xì)胞內(nèi)TG含脂蛋白進(jìn)程,LRP6所在12p13區(qū)域包括TNFRSF和TNFRSF7基因,TNF受體家族成員明顯影響脂代謝和心血管的整體性。腫瘤壞死因子α（TNFα）和其他炎癥細(xì)胞因子的分泌被視為一個(gè)重要的肥胖相關(guān)的因素從而導(dǎo)致MS[8]。但LRP6是否與肥胖有關(guān)仍無確切研究。

目前LRP6基因R611C是否能引起高血壓及具體機(jī)制尚未報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn)與吉林漢族地區(qū)患者高血壓無相關(guān)性。SheidaMani等[9,10]2008年在小鼠上發(fā)現(xiàn) LRP6基因 R611C控制的表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFP）突變同高膽固醇血癥和早發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān),但它引起疾病的機(jī)制尚不清楚。SheidaMani等人推測(cè)LRP6基因R611C作用機(jī)制為L(zhǎng)RP6突變受體在酸性環(huán)境中增加突變受體的親和力而導(dǎo)致在較晚的內(nèi)吞體中LDL出現(xiàn)損傷分離,而這些內(nèi)吞體能協(xié)調(diào)LDL與漿細(xì)胞膜之間循環(huán),從而減低了對(duì)LDL清除作用,可引起引起MS的一個(gè)表型高脂血癥、高膽固醇血癥。研究表明LRP6基因R611C在小鼠實(shí)驗(yàn)中可引起高脂血癥,本研究亦證實(shí)了LRP6基因R611C基因多態(tài)性與吉林地區(qū)漢族MS組中高脂血癥的發(fā)生具有相關(guān)性。目前關(guān)于LRP6基因R611C基因多態(tài)性的研究有一定的進(jìn)展,但是LRP6基因R611C在MS病理生理中的確切機(jī)制及地位還需進(jìn)一步證實(shí)。隨著其作用機(jī)制日益明確和研究深入,該基因有望成為MS治療的新的靶位點(diǎn)。

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