張治宇,苑福升,李力卓,胡 碩,孔大亮,高志學(xué)

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院骨科,遼寧沈陽(yáng)110031;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科;3.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院骨科;4.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;5.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)北京順義醫(yī)院骨科）

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)手段研發(fā)的新型抑癌基因、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)染病毒等的抗腫瘤制劑已成為繼手術(shù)、化療、放療之后最具有應(yīng)用前景的腫瘤治療方法[1,2]。雞痘病毒基因組龐大,不僅可以有效的感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)早期基因,而且重要的是其不在感染的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有感染性的病毒粒子[3-5],本文檢測(cè)了以為雞痘病毒載體構(gòu)建的含HN基因的重組雞痘病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞SAOS-2的體外抑瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

含HN基因的重組雞痘病毒（rFPVHN）由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院11所構(gòu)建并保存;SAOS-2腫瘤細(xì)胞由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室保存;Rhodamine123購(gòu)自寶生物公司;MTT購(gòu)自SIGMA公司;流式細(xì)胞儀BD FACSAria為DB公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀Takara公司產(chǎn)品;1640培養(yǎng)基購(gòu)自寶生物公司。

1.2 MTT染色法檢測(cè)殺傷率

消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SAOS-2腫瘤細(xì)胞,計(jì)數(shù)（1×104個(gè)/孔）后培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37℃,5%CO2條件下,培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。用無(wú)血清無(wú)雙抗的 RPM I1640稀釋FPV及vFV 3,以100MOI感染SAOS-2腫瘤細(xì)胞,2 h后補(bǔ)加完全的營(yíng)養(yǎng)液（10%FBSRPMI1640）,分別于感染后 24、48、72 和 96 h,加入20μlMTT溶液（5mg/ml,溶于PBS中,經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾除菌）,37℃,5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl DMSO,振蕩10 min。應(yīng)用酶標(biāo)儀,于490 nm處檢測(cè)各孔A值,并按以下公式計(jì)算殺傷率。

1.3 流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位

消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（2×105個(gè)/孔）,細(xì)胞貼壁后,以100 moi的 rFPVHN感染,37℃、5%CO2培養(yǎng) 2小時(shí)后補(bǔ)加完全的營(yíng)養(yǎng)液。于感染后72 h后收集細(xì)胞,棄上清,PBS洗2次后重懸于300μl PBS中,加2μl 20 mg/m l Rhodamine123,避光室溫放置0.5小時(shí),PBS洗2次,流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。

1.4 含HN的重組雞痘病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后唾液酸含量的測(cè)定

收集轉(zhuǎn)染72 h的OS732細(xì)胞,PBS洗2次,用100μl重蒸水重懸細(xì)胞,冰浴中用超聲波細(xì)胞破碎儀制備細(xì)胞樣品,按文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行唾液酸含量的測(cè)定。在721紫外分光光度計(jì),560 nm處測(cè)定唾液酸的A560值,取其平均值。

1.5 Caspase-3活性測(cè)定

250 g離心5min收集 2×106-5×106個(gè)細(xì)胞,用pH7.2的冷PBS洗1次,用200溶解緩沖液重懸。冰上孵育細(xì)胞30min。13 000 r/min離心5min,取上清做蛋白定量并進(jìn)行Caspase-3活性測(cè)定。在水或DMSO中溶解底物DEVD-pNA或YVAD-pNA,配置成20mmol/L的儲(chǔ)存液,-20℃避光保存。在100μg-500μg蛋白抽提物中底物濃度160-200μmmol/L,終體積50-100。將反應(yīng)混合液置微量滴定板中,用微量滴定板分析儀在405 nm濾光片下讀取反應(yīng)數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)SAOS-2細(xì)胞死亡率

MTT法檢測(cè)結(jié)果表明在感染量一定的條件下,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),rFPVHN致SAOS-2腫瘤細(xì)胞的死亡率也有所升高,在72 h達(dá)到峰值,繼而下降（圖1）。隨著感染量的增高,在相同的作用時(shí)間內(nèi),rFPVHN致SAOS-2 SAOS-2細(xì)胞的死亡率均有所升高,但并不形成嚴(yán)格的劑量效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明重組病毒感染SAOS-2腫瘤細(xì)胞72 h后可最大限度地殺傷SAOS-2。

2.2 Rhodam ine123結(jié)合FACS檢測(cè)線粒體功能

SAOS-2腫瘤細(xì)胞感染rFPVHN 72 h,SAOS-2線粒體吸附Rhodamine123的能力下降,流式細(xì)胞儀檢測(cè)與正常SAOS-2腫瘤細(xì)胞及FPV感染的SAOS-2腫瘤細(xì)胞相比,被rFPVHN感染的SAOS-2腫瘤細(xì)胞峰向左移（圖2）,說(shuō)明rFPVHN的感染導(dǎo)致SAOS-2腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降。

2.3 rFPVHN感染SAOS-2細(xì)胞后唾液酸含量的測(cè)定

從表1看,rFPVHN組血清唾液酸含量最低。這說(shuō)明HN基因在體內(nèi)發(fā)揮了神經(jīng)氨酸酶的作用,顯著降低了血清中唾液酸的含量。

圖1 FPVHN致SAOS-2腫瘤細(xì)胞死亡率

圖2 SAOS-2腫瘤細(xì)胞感染rFPVHN后線粒體吸附能力變化

表1 Sialic acid contents of infected SAOS-2 cells

2.4 Caspase-3活性測(cè)定

rFPVHN轉(zhuǎn)染SAOS-2腫瘤細(xì)胞72 h后提取SAOS-2腫瘤細(xì)胞細(xì)胞漿蛋白質(zhì),利用特異性發(fā)色底物檢測(cè)Caspase-3活性。從D值結(jié)果可以看出,rFPVHN轉(zhuǎn)染SAOS-2腫瘤細(xì)胞72 h后激活了Caspase-3（圖3）。

圖3 rFPVHN轉(zhuǎn)染SAOS-2腫瘤細(xì)胞后Caspase-3活性變化

3 討論

骨肉瘤惡性度大,發(fā)病率高,轉(zhuǎn)移較早,致殘率高,好發(fā)于青少年和年輕成人,是惡性骨腫瘤中具有代表性的腫瘤,80%的骨肉瘤患者在確診時(shí)已經(jīng)在體內(nèi)產(chǎn)生微小的轉(zhuǎn)移灶。近年來(lái)隨著新輔助化療技術(shù)及隨之開展的保肢技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用,不僅僅使患者免受截肢之苦,患肢肢體功能明顯改善,而且患者的5年生存率較20年以前有了顯著的提

高[1-2]

?？墒沁@并不能掩蓋新輔助化療及保肢治療技術(shù)手術(shù)的局限性和其缺點(diǎn),既新輔助化療及手術(shù)治療都是立足于直接殺傷腫瘤細(xì)胞,雖然殺滅了大多數(shù)腫瘤細(xì)胞,但是使正常組織受到同樣的傷害,重要的是無(wú)法作到徹底消滅腫瘤細(xì)胞及微小的轉(zhuǎn)移灶。

本研究中,測(cè)得rFPVHN可以導(dǎo)致SAOS-2細(xì)胞表面唾液酸明顯減低。證明新城疫病毒HN基因表達(dá)產(chǎn)物HN蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性使其水解了SAOS-2腫瘤細(xì)胞表面的唾液酸,使SAOS-2腫瘤細(xì)胞表面抗原暴露于機(jī)體強(qiáng)大的免疫系統(tǒng),增強(qiáng)了免疫系統(tǒng)對(duì)SAOS-2腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷,這和相關(guān)研究表明新城疫病毒HN蛋白可以水解腫瘤細(xì)胞表面唾液酸,在一定程度上抑制了腫瘤細(xì)胞的免疫逃避[7]是一致的。

另外MTT法檢測(cè)結(jié)果表明。在感染量一定的條件下,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),rFPVHN致SAOS-2腫瘤細(xì)胞的死亡率也有所升高,在72 h達(dá)到峰值,繼而下降。流式細(xì)胞儀檢測(cè)被rFPVHN感染的SAOS-2腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降,72h后激活了Caspase-3。這說(shuō)明在體外實(shí)驗(yàn)中,含HN基因的重組雞痘病毒可以導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞SAOS-2凋亡,其可能是通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞SAOS-2細(xì)胞凋亡,至于骨肉瘤細(xì)胞SAOS-2確切的凋亡機(jī)制還需要進(jìn)一步更深層次研究。

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