鄧 欣,張 帆,張國利,李亙松,b,于秉治

（1.中國醫(yī)科大學(xué)a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗中心;b.生理學(xué)教研室;c.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,遼寧沈陽110001;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院11所）

受精卵的發(fā)育過程是卵細(xì)胞內(nèi)一系列信號蛋白相互作用的結(jié)果。蛋白激酶B（PKB/Akt）在其發(fā)育的過程中起了至關(guān)重要的促進作用[1],通過磷酸化Cdc25BSer351進而去磷酸化Cdc2A Tyr15而使有絲分裂促進因子MPF活化,然后1-細(xì)胞期受精卵分裂為2-細(xì)胞期受精卵。我們最近的研究脯氨酸豐富的肌醇多磷酸5-磷酸酶（PIPP）,在Akt的活化過程中起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[2-6]。Akt的活化需要PtIns（3,4,5）P3與Akt的PH域結(jié)合才能完成,而PIPP卻可以水解PtIns（3,4,5）P3上第5位的磷酸鹽PtIns（3,4）P2,從而抑制Akt的活化。本研究通過細(xì)胞免疫熒光分析法使用HA-PIPPH557A質(zhì)粒觀察其在受精卵中對卵裂的作用,并與HA-PIPP的作用進行比較,我們研究將為深入研究PIPP在小鼠受精卵早期發(fā)育中的信號傳遞作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和菌株 HA-PIPPH557A和HA-PIPP以及HA vector由Mitchell教授惠贈（澳大利亞Monash大學(xué)）;DH5α購自大連寶生物有限公司。

1.2 動物來源 中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供昆明系4-5周齡性成熟雄性及雌性小白鼠。

1.3 相關(guān)分子生物學(xué)試劑 孕馬血清促性腺激素（PMSG）購自長春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所;人絨毛促性腺激素（hCG）購自中國醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院藥局;小鼠抗pAkt Ser473多克隆抗體;辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG（Santa）及FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的兔抗IgG抗體購自北京中山生物技術(shù)公司:Wortmannin,Hochest33258熒光染料購于Sigma公司。限制性內(nèi)切酶M luI（MBI公司）;質(zhì)粒DNA純化試劑盒（上海生工）;LB培養(yǎng)基（Invitrogen）;牛血清白蛋白（BSA,FractionⅤ）;M2培養(yǎng)液;礦物油;M16培養(yǎng)液（Sigma）;氨芐青霉素（Amp）（哈藥集團制藥總廠）。

1.4 小鼠超排卵及受精卵的采集和培養(yǎng) 根據(jù)Hogan的方法進行小鼠卵的超排和收集[7]。

1.5 質(zhì)粒 DNA提取與轉(zhuǎn)染 HA-PIPP、HA

PIPPH557A和HA vector經(jīng)轉(zhuǎn)化,提取后,經(jīng)M luI（5'-A^CGCGT-3';3'-TGCGC^T-5'）單酶切進行鑒定,用1%瓊脂糖電泳檢測酶切結(jié)果,選擇酶切片段大小與預(yù)期相符合的陽性克隆保存用做重組質(zhì)粒構(gòu)建。

轉(zhuǎn)染前分別將小鼠受精卵接種于含100μlM16培養(yǎng)液的96孔板中,轉(zhuǎn)染時受精卵處于G1期（受精后0-9 h）。脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000的轉(zhuǎn)染按試劑說明書進行。無菌條件下,在含24.5μl的M16培養(yǎng)液的 Eppendorf管中加入 0.5μl的 LipofectamineTM2000脂質(zhì)體,同時在另一含 23.5μl的 M16培養(yǎng)液中加入1.5μl（0.2μg）HA-PIPP或HA vector質(zhì)粒,室溫靜置5min。然后加入脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物共50μl置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,吸去培養(yǎng)液,加入正常培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。以上各孔重復(fù)3次。

1.6 間接免疫熒光 取轉(zhuǎn)染HA-PIPP組和HAPIPPH557A組受精卵放入4%的多聚甲醛中固定30 min,0.1%Triton x-100固定10min,用含1%牛血清白蛋白的PBS室溫下封閉40min,加入抗pAktSer473的抗體（1∶500）4℃過夜,次日加入FITC標(biāo)記的一抗（1∶1 000）37℃40min,用碘化丙啶（PI）染色4 min,使核酸著色,在激發(fā)光為488 nm和530 nm的熒光顯微鏡下觀察pAktSer473的定位以及在HA-PIPP或HA-PIPPH557A作用下發(fā)生卵裂的相應(yīng)改變。

1.7 受精卵卵分裂的計數(shù) 受精卵分為5組:未處理組（untreated）、渥太霉素組（wortmannin）、轉(zhuǎn)染HA vector組、HA-PIPP組和HA-PIPPH557A組,之后在M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)至G2/M轉(zhuǎn)換期,在HCG注射后30 h計數(shù)1-細(xì)胞期受精的分裂數(shù),并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進行one-way ANOVA檢驗,值用mean±SD表示,每組實驗重復(fù)3次,P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相差顯微鏡下HA-PIPPH557A的過度表達(dá)對受精卵卵裂的形態(tài)學(xué)觀察 轉(zhuǎn)染HA-PIPPH557A與HAPIPP質(zhì)粒的小鼠受精卵分別在M 16培養(yǎng)液中培養(yǎng),記錄各組細(xì)胞卵裂情況,并于注射hCG后30 h,相差顯微鏡下觀察并照相。在轉(zhuǎn)染HA-PIPPH557A組,hCG注射26 h處于1-細(xì)胞期,27 h開始出現(xiàn)2-細(xì)胞期受精卵,到30 h有大約半數(shù)以上的卵達(dá)到了2-細(xì)胞期,然而,轉(zhuǎn)染HA-PIPP組僅不到15%的卵進入2-細(xì)胞期（圖1）。

2.2 HA-PIPPH557A的過渡表達(dá)對受精卵卵裂率的影響 G1期受精卵分別用HA-PIPPH557A（0.05 ng）、HA-PIPP（0.05ng）、HAvector（0.05ng）和Wortmannin處理以及未處理的卵。相差顯微鏡下計數(shù)發(fā)生卵裂的個數(shù)。HA-PIPPH557A、HA vector以及未處理組在hCG后28.5 h開始出現(xiàn)卵裂,至30 h約有55%以上分裂成2-細(xì)胞期胚胎,三組之間相比差異沒有顯著意義（P＞0.05）。HA-PIPP與Wortmannin處理組卵裂率均低于15%,它們的結(jié)果與FLAG-PIPP-H557A處理組相比差異顯著（P＜0.001）,（見表1和圖2）,每組實驗至少重復(fù)3次。

圖1 PIPPH557A對小鼠受精卵卵裂的形態(tài)學(xué)觀察

圖2 HA-PIPPH557A的過度表達(dá)對受精卵卵裂率的影響

表1 小鼠受精卵分裂百分?jǐn)?shù)的組間比較

3 討論

本研究顯示HA-PIPPH557A對小鼠受精卵卵裂的影響,揭示了 PIPPH557A作為 PIPP的失活形式在PI3K/Akt信號途徑中對受精卵發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。以前對體細(xì)胞的研究報道顯示,PIPP可以降低Akt Ser473的磷酸化。我們以前的研究也顯示,Akt在小鼠受精卵的有絲分裂過程中可以促進MPF的活化進而促進受精卵的有絲分裂,而PIPP可以通過抑制Akt活性調(diào)節(jié)G2/M期的轉(zhuǎn)化,降低受精卵的卵裂率和MPF的活性。

以前的報道顯示,PI3K活化可以產(chǎn)生PtdIns（3,4,5）P3,PtdIns（3,4,5）P3與Akt PH域的結(jié)合使Akt活化并聚集在細(xì)胞膜上[8,9],活化的Akt可以特異性的促進受精卵的有絲分裂,而作為Akt的抑制劑PIPP對PtdIns（3,4,5）P3第5位磷酸鹽的的水解作用,相應(yīng)的降低了Akt活化進而降低MPF的活性。我們以前的結(jié)果與上述報道相一致。而PIPP的5-磷酸酶結(jié)構(gòu)域中組氨酸557位點突變?yōu)楸彼釙r的PIPPH557A對Akt以及在小鼠受精卵中的作用,一直沒有文獻報道。小鼠受精卵是研究脊椎動物細(xì)胞周期較好的模型之一,關(guān)于小鼠受精卵的早期發(fā)育機制一直是國內(nèi)外研究的熱點之一,而眾多關(guān)于有絲分裂的研究幾乎都工作在細(xì)胞是如何跨越分裂間期（包括G1、S和G2期）到達(dá)分裂期（M 期）[7-10]。本研究使用HA-PIPPH557A通過熒光顯微鏡和解剖顯微鏡觀察了PIPPH557A對小鼠受精卵卵裂的影響,我們發(fā)現(xiàn)PIPPH557A與PIPP的活性形式不同,它不能阻止Akt在細(xì)胞膜定位的活化形式進而不能阻止受精卵的卵裂。,所以PIPPH557A在受精卵發(fā)育的有絲分裂過程中起了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

總之,我們的實驗結(jié)果顯示PIPPH557A在小鼠受精卵發(fā)育的有絲分裂過程中起了重要的調(diào)節(jié)作用,它可以通過減弱PIPP對AktSer473位點的磷酸化的抑制作用,間接調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的進程。

致謝:感謝澳大利亞Monash大學(xué)的Mitchell教授贈送我們HA-PIPPH557A和HA-PIPP質(zhì)粒。

[1]Chen Feng,Aiming Yu,Bingzhi Yu,et al.Involvement of protein kinase B/AKT in early development ofmouse fertilized eggs[J].Biolreprod,2007,77（3）:560.

[2]Mitchell CA,Gurung R,Kong AM,et al.Inositol polyphosphate 5-phosphatases:lipid phosphataseswith flair[J].IUBMB Life 2002,53（1）:25.

[3]Gurung R,Tan A,Ooms LM,et al.Identification of a Novel Domain in Two Mammalian Inositol-polyphosphate 5-Phosphatases That Mediates Membrane Ruffle Localization[J].JBiolChem.2003,278（13）:11376.

[4]Ooms LM,M cColl BK,W iradjaja F,et al.The Yeast Inositol Polyphosphate5-Phosphatases Inp52p and Inp53p Translocate to Actin Patches following Hyperosmotic Stress:Mechanism for Regulating Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate at Plasma Membrane Invaginations[J].Mol.Cell Biol.2000,20（24）:9376.

[5]Kong AM,Horan KA,Sriratana A,et al.Phosphatidylinositol 3-Phosphate[PtdIns（3）P]Is Generated at the Plasma Membrane by an Inositol Polyphosphate 5-Phosphatase:Endogenous Ptd Ins（3）P Can Promote GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane[J].MolCell Biol.2006,26（16）:6065.

[6]Lisa MO,Clare GF,M egan VA,et al.The Inositol Polyphosphate 5-Phosphatase,PIPP,Is a Novel Regulator of Phosphoinositide 3-K inase-dependentNeurite Elongation[J].Mol.Biol.Cell,2006,17（2）:607.

[7]Solomon MJ,GlotzerM,Lee TH,et al.Cyclin activation of p34CDC2[J].Cell.1990,63（5）:1013.

[8]Coronas S,RamelD,Pendaries C,etal.PtdIns5P:a littlephosphoinositide with big functions?[J].Biochem Soc Symp.2007,74:117-28.Review.

[9]鄧 欣,李亙松,朱麗娜,等.蛋白激酶B（AKT）抑制劑對小鼠1-細(xì)胞期胚胎分裂的影響[J].生殖與避孕,2009,29（6）:349.

[10]Surabhi D,Hyukjin C,Paul S.Requirement for phosphatidylinositol-3 kinase activity during progression through S-phase and entry into m itosis[J].CellularSignalling.2003,15（7）:667.