樊 昕,任曉萍,李海濤,楊蓉婭

（北京軍區(qū)總醫(yī)院·全軍皮膚病診治中心,北京 100125）

近年來,由生物被膜引起的微生物耐藥明顯增加,有學者認為大于80%的人類感染中有生物被膜的形成[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多因素可以影響真菌生物被膜的形成,如物理性質:基質,碳源,唾液的存在,氧氣的存在,表面限定,酸堿環(huán)境;環(huán)境因素:熱,冷,紫外線;真菌的種類等[2]。本實驗以不同培養(yǎng)條件下,如不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH值觀察其對T.asahii BF形成的影響,為臨床研究真菌生物被膜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 阿薩希毛孢子菌株1株,為本院皮膚科臨床分離株（BZP07002）,并經(jīng)API20AUX生化鑒定及DNA序列分析驗證（AS2.2174）[3];RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司,XTT試劑購自美國AppliChem公司,PMS購自Sigma公司,倒置顯微鏡購自日本Olympus公司,全自動酶聯(lián)免疫測定儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜體外構建 將-80℃保存的阿薩希毛孢子菌菌種復蘇,在沙氏培養(yǎng)基中轉種培養(yǎng)2次,轉入酵母蛋白胨葡萄糖肉湯（YPD）中過夜振蕩培養(yǎng),離心、收集后,重懸于 RPMI-1640中,稀釋成106CFU/ml菌懸液。在培養(yǎng)板中預先放入無菌的聚苯乙烯（長寬各為1.0 cm）。將2m l該菌懸液加入到24孔培養(yǎng)板中,選擇30℃培養(yǎng) 48-72 h。2 h時PBS緩沖液沖洗2次,重新加入2.0m lRPMI-1640培養(yǎng)液。之后每隔24 h更換一次培養(yǎng)液。設不加有阿薩希毛孢子菌的空白對照組。

1.2.2 生物被膜形成的定量分析 通過XTT還原比色測定法進行定量分析。測定依據(jù)通過代謝活性細胞使黃色的四唑鹽XTT分裂成橘黃色的甲染料。RPM I1640培養(yǎng)液中加入XTT和電子耦合劑PMS使終濃度為12.5μmol/L。在預先洗滌培養(yǎng)的生物膜孔和空白對照孔中放入1.5 ml的XTT-PMS溶液,30℃避光培養(yǎng)2 h。離心上清液平分在96孔板中,微量滴定板492 nm下讀數(shù)。同時將含有生物被膜的聚苯乙烯材料放入YPD液體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)48 h,通過細胞計數(shù)板計數(shù)評估總的活菌數(shù)。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察 將已構建生物被膜的聚苯乙烯用滅菌的PBS緩沖液沖洗2次,放置在載玻片上倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4 不同pH值培養(yǎng)基和吸光度檢測 取菌懸液50μl加入含有不同pH培養(yǎng)基150μl/孔的96孔板,分3組不同pH:pH=5.0,pH=5.0-7.0（前24 h培養(yǎng)基ph=7.0,后48 h培養(yǎng)基ph=5.0）,pH=7.0培養(yǎng);實驗過程中每組做3個平行孔,重復3次實驗,以不含菌懸液的孔作為基線對照;48-72 h取出相應的96孔板。吸出孔內(nèi)菌懸液,PBS清洗孔3次去除浮游菌,微孔板在室溫下干燥30min;加入1%Crystal Violet200μl/孔染色,放置20min后吸出染液,PBS清洗孔3次去除孔壁染液,微孔板在室溫下干燥30min;加入95%乙醇200μl/孔微量振蕩器上震蕩30min復吸染液,復吸液放入一新的96孔微孔板中;全自動酶聯(lián)免疫儀測定630 nm處的吸光（OD）值,并繪制曲線。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。采用單因素方差分析（F檢驗）和LSD-t檢驗進行多個樣本均數(shù)的兩兩比較。取α=0.01為檢驗水準,P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同培養(yǎng)溫度下生物被膜的形成

以T.asahii聚苯乙烯表面形成生物被膜48 h為評價標準觀察其20℃,25℃,30℃,35℃和40℃不同溫度下生物膜形成的差異性。其隨著溫度不斷升高,其生物被膜形成速度加快,但是超過40℃時穩(wěn)定性逐漸降低。見表1,圖1。

表1 不同培養(yǎng)溫度下阿薩希毛孢子菌生物被膜的定量XTT測定（±s±s）和活菌計數(shù)溫度 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 40℃XTT值 0.131±0.012 0.984±0.045 1.312±0.101 1.105±0.101 0.793±0.019活菌數(shù) 1.73×106 7.86×106 10.23×106 8.92×106 6.16×106

圖1 不同培養(yǎng)溫度下阿薩希毛孢子菌生物被膜的定量XTT測定和活菌計數(shù)

2.2 不同pH培養(yǎng)基下生物被膜的形成

用全自動酶聯(lián)免疫測定儀630 nm可見光測定阿薩希毛孢子菌生物被膜OD值時發(fā)現(xiàn),在體外pH=5.0時和pH=9.0不能形成生物被膜;pH=7.0時生物被膜形成表現(xiàn)為緩慢的非線性生長,24-48 h生物被膜開始成熟,48 h-56 h間出現(xiàn)一相對的生長停滯期,此后OD值下降,生物被膜老化,pH=5.0對已經(jīng)形成24 h的阿薩希毛孢子菌生物膜生長有明顯的抑制作用,但經(jīng)歷12 h的酸休克后生物被膜 均能恢復生長。見表2,圖2,3。

表2 不同pH培養(yǎng)條件下阿薩希毛孢子菌生物膜的定量XTT測定（±s±s）和活菌計數(shù)pH值 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 XTT值 0.053±0.005 0.559±0.037 1.439±0.123 0.417±0.037 0.033±0.002活菌數(shù) 0.73×106 5.89×106 11.48×106 3.98×106 0.51×106

圖2 不同pH培養(yǎng)條件下阿薩希毛孢子菌生物膜的定量XTT測定和活菌計數(shù)

圖3 不同pH培養(yǎng)條件下阿薩希毛孢子菌生物膜形成情況

3 討論

播散性毛孢子菌病呈世界性分布,是一種慢性、頑固、難治的系統(tǒng)性真菌病,其發(fā)病呈逐年上升的趨勢[4],T.asahii是引起該病的重要致病菌。近年來各種醫(yī)用材料（各種支架、導管、瓣膜、起搏器、人工關節(jié)等材料）的使用率很高,而微生物易于粘附于其表面且可形成生物被膜,導致耐藥性增加而感染灶不易清除[5]。相對于其懸浮狀態(tài)而言,被膜內(nèi)菌細胞的形態(tài)常與浮游菌不同,且對藥物的敏感性差[6]。我們發(fā)現(xiàn)真菌耐藥現(xiàn)象越來越普遍,主要由于近年來抗真菌藥物品種和臨床使用量的增多,以及藥物的選擇性壓力,特別是一些侵入性治療如體外插管等操作致使耐藥真菌數(shù)量及種類迅速增加,不僅影響藥物的治療效果,而且呈現(xiàn)出交叉耐藥[7]。

既往我們的研究表明[8]:阿薩希毛孢子菌可以形成生物被膜,包括真菌表面粘附,微菌落形成,生物被膜成熟,生物被膜中阿薩希毛孢子菌的活性隨培養(yǎng)時間延長而增加,當生長趨于成熟時,代謝的活性相對穩(wěn)定,但仍保持在一個高水平。進一步研究我們發(fā)現(xiàn)[9]:成熟期T.asahii BF不同層面的活菌數(shù)和活性差別均無統(tǒng)計學意義,生物被膜中存在孔隙結構,活菌圍繞在孔隙周圍并被死菌包裹,使活菌一方面可直接從孔隙中獲得營養(yǎng),又可抵御環(huán)境中有害物質的破壞。但是不同的培養(yǎng)條件是否會影響生物被膜的形成,其主要變化趨勢是什么,對于阿薩希毛孢子菌形成生物被膜的最佳培養(yǎng)條件是什么?

通過本研究發(fā)現(xiàn):不同培養(yǎng)溫度會明顯影響生物被膜的形成。在聚苯乙烯表面形成生物膜48 h為評價標準觀察其20℃,25℃,30℃,35℃和40℃不同溫度下生物膜形成,其隨著溫度不斷升高,其生物膜形成速度加快,但是超過40℃時穩(wěn)定性逐漸降低,但是相對于浮游狀態(tài)其對溫度的耐受性更高。分析其生物膜形成主要是依靠真菌本身增殖情況和在合適的條件下才能聚集、黏附和逐漸形成生物膜,但是較低溫度時真菌活性較低,增殖較慢無法形成生物被膜結構;但是在較高溫度雖然真菌活性較高但是由于活菌量增多與死菌量增多不成比例導致菌體間黏附性明顯改變,其表現(xiàn)為穩(wěn)定性降低,其形成的生物被膜穩(wěn)定性相應降低最終導致生物被膜活性降低等一系列變化[2]。我們認為30-35℃是 T.asahii BF形成的合適溫度,這也是大部分真菌培養(yǎng)的合適溫度。

本研究發(fā)現(xiàn)不同pH條件下生物被膜生長變化較大,在體外過酸pH=5.0或者過堿pH=9.0時不能形成生物被膜,分析其主要是有在這種條件下真菌活性明顯受到影響,活力下降甚至死亡而不能生成生物被膜。我們的研究結果表明pH=7.0條件下生物被膜形成表現(xiàn)為緩慢的非線性生長,6 h生物被膜已經(jīng)形成,12-24 h生物被膜成熟,24-36 h出現(xiàn)一相對的生長停滯期,此后由于生物被膜中死菌比例增加,易于脫落的死菌在檢測前被洗滌棄去,提示生物被膜處于老化階段。pH=5.0時菌株不能形成生物被膜,但已經(jīng)成膜12h的生物膜卻可耐受pH=5.0酸的影響,雖然酸對生物被膜生長有明顯的抑制作用,但是經(jīng)歷12 h的酸休克后菌株的生物被膜均能在低pH條件下（pH=5.0）恢復生長。該現(xiàn)象證實生物被膜狀態(tài)的阿薩希毛孢子菌具有更強的抗酸能力,能在較低pH條件下代謝生存,這可能與生物被膜特有的結構有關:生物被膜是由胞外基質包裹的相互黏附的真菌性群體組成的三維結構,該結構是生物膜真菌的保護裝置,可有效抵御酸性的滲透[10]。在這種狀態(tài)下,酸只能對表層真菌有影響,而無法對深層真菌發(fā)揮作用。其次生物膜中營養(yǎng)成分的濃度由外向內(nèi)呈現(xiàn)梯度下降,致使深層真菌長期處于營養(yǎng)缺失狀態(tài)而生長緩慢。生物膜深層真菌所處的這種緩慢生長狀態(tài),也稱為饑餓狀態(tài),處于該狀態(tài)的真菌對酸性的敏感性降低,這可能是生物被膜耐酸的另外一個原因。

總之,通過本研究發(fā)現(xiàn)30-35℃,培養(yǎng)基pH=7.0時 T.asahii BF的形成能力最強,但是其溫度的影響機制特別是在酸性環(huán)境中能夠恢復一定程度生長的具體調控機制尚待進一步深入研究,這也是我們今后研究的方向和主要內(nèi)容。

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