馮瑞軍

(新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830021)

0 引 言

酶催化反應(yīng)的選擇性有很好的實(shí)用價(jià)值，近年來(lái)日益受到人們的重視.近年來(lái)對(duì)酶的選擇性的研究主要集中在立體選擇性及對(duì)映體的拆分上[1,2]，而對(duì)水解中酶的位置選擇性和脂肪酸類型選擇性的研究鮮有報(bào)道.本文所用脂肪酶Lipase LVK來(lái)源于黑曲霉，文獻(xiàn)對(duì)其專一性的報(bào)道并不一致.另外，脂肪酶Lipase F-AP15是一種sn-1,3位選擇性脂肪酶，其選擇性水平有待研究.本文對(duì)脂肪酶Lipase LVK、Lipase AY 30G 以及Lipase F-AP15的位置選擇性、脂肪酸選擇性進(jìn)行了研究測(cè)試.

1 材料和方法

1.1 主要原料及試劑

脂肪酶Lipase LVK(粗酶粉，深圳市綠微康生物工程有限公司)，來(lái)源于黑曲霉，活力為25 000 U/g.

Lipase AY 30G (Amano Enzyme INC NAGOYA, Japan,天野公司惠贈(zèng))，來(lái)源于假絲酵母，活力為30 000 U/g.

Lipase F-AP15 (Amano Enzyme INC NAGOYA, Japan，天野公司惠贈(zèng))，來(lái)源于根霉，其活力為150 000 U/g.

紅花油，產(chǎn)地：伊犁，碘值[4]：146.2 mg/g，其脂肪酸含量氣質(zhì)色譜分析結(jié)果見表1.

表1 紅花油中脂肪酸含量分析

0.1 mol/L氫氧化鉀/乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.5 mol/L氫氧化鉀/乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液.

0.1 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mol/L氯化碘冰醋酸標(biāo)準(zhǔn)溶液重鉻酸鉀(基準(zhǔn)物)，薄層層析硅膠G.

1.2 儀器及設(shè)備

ZD-8802型搖床(太倉(cāng)市科教器材廠)；Orion 828型酸度計(jì)(美國(guó)奧立龍).高速組織搗碎機(jī)；微量注射器.

1.3 分離及檢測(cè)方法

1.3.1 水解產(chǎn)物中脂肪酸與混合酯的分離方法

向洗去酶粉后的水解產(chǎn)物中加入酚酞指示劑，加入0.5 mol/L KOH/乙醇至溶液呈深紅色, KOH優(yōu)先與脂肪酸(FFA)形成水溶性皂[3],加入適量水﹑正己烷及適量乙醇，溶液中脂肪酸皂與混合酯分離；上層溶液蒸去正己烷后得到混合酯；下層溶液(脂肪酸皂的水溶液)中加入6 mol/L HCl，調(diào)節(jié)至pH為2，用正己烷提取上層脂肪酸，蒸去正己烷后，得到游離脂肪酸.

1.3.2 單甘酯含量的測(cè)定

由于所用紅花油的不飽和度較高，因此直接用常規(guī)方法[4]測(cè)定產(chǎn)物中的單甘酯含量時(shí)誤差較大，實(shí)驗(yàn)中加入足量的氯化碘(ICl)-冰乙酸溶液，使其不飽和鍵轉(zhuǎn)化為飽和鍵，以消除不飽和鍵的干擾,從而適用于不飽和酯的測(cè)定.

精稱兩份去脂肪酸的酯類混合物0.05～0.06 g，兩份質(zhì)量相同(否則需作韋氏液空白并對(duì)體積折算),分別置于具塞三角瓶中,兩瓶中都加入氯仿及0.1 mol/L ICl-冰乙酸溶液各10 mL,搖勻置暗處反應(yīng)50 min后,其中一份加入KI溶液及去離子水,用0.1 mol/L Na2S2O3滴定至終點(diǎn)(與測(cè)碘值[5]相同)，滴定量為V1；另一份加入0.07 mL 56%高氯酸溶液及25 mL 0.3%高碘酸-冰乙酸溶液,35 min后,同上述滴定至終點(diǎn), 滴定量計(jì)為V2；同時(shí)作空白，滴定量計(jì)為V0，按下式計(jì)算單甘酯含量:

式中,V=V2-V1,m為稱取樣品質(zhì)量,c為Na2S2O3摩爾濃度,354.56為單亞油酸甘油酯的相對(duì)分子質(zhì)量.

1.3.3 脂肪酸位置選擇性的測(cè)定

自制20 cm×20 cm硅膠G薄板，硅膠厚度0.2～0.5 mm.將水解產(chǎn)物中分去游離脂肪酸，混合酯溶于乙醚，在薄板上展開，展開劑為V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=15∶1，飽和碘蒸氣顯色.測(cè)量單酯、二酯、三酯顯色斑點(diǎn)面積，比較3種酯的相對(duì)含量作為參考.

通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物中3種酯的含量，可初步判斷脂肪酶是否有位置選擇性.

1.3.4 脂肪酸種類選擇性的測(cè)定

在一定水解率下，分離水解產(chǎn)物中的游離脂肪酸和混合酯，分別測(cè)定脂肪酸和混合酯的碘值，可判定脂肪酶對(duì)脂肪酸類型有無(wú)選擇性.

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酸位置選擇性

表2 脂肪酸位置選擇性分析結(jié)果

以3種酶水解紅花油，水解條件為35 ℃,200 r/min，m(油):m(水)=1，以3種水解率的產(chǎn)物為樣品, 薄層分析單酯(MG)﹑二甘酯(DG)﹑三甘酯(TG)的含量,分析結(jié)果見表2.單甘酯含量測(cè)定結(jié)果見表3.

表3 單甘酯含量測(cè)定結(jié)果

對(duì)比表3中單甘酯含量與表2中采用薄層層析法所得單甘酯含量，結(jié)果具有一致性，說(shuō)明結(jié)果可靠.可以看出，脂肪酶Lipase LVK和 Lipase AY 30G在水解初期(水解率10%左右)，水解產(chǎn)物中即開始出現(xiàn)單甘酯；在水解率達(dá)33%左右時(shí)，二甘酯含量比例并不高，在水解率達(dá)66%左右時(shí)，單甘酯含量亦未占優(yōu)勢(shì)，且體系中仍有未水解的三甘酯存在，這表明脂肪酶Lipase LVK和 Lipase AY 30G沒(méi)有酯鍵位置選擇性.而脂肪酶Lipase F-AP15在實(shí)驗(yàn)條件下顯示了一定程度的位置選擇性：水解率為10%左右時(shí)，體系中單甘酯含量很少，水解率為33%左右時(shí)，體系中二甘酯含量較高，水解率為66%左右時(shí)，體系中單甘酯含量占較大優(yōu)勢(shì).

表4 脂肪酸種類選擇性分析

2.2 脂肪酸種類選擇性

紅花油中飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.71%，紅花油中除亞油酸外的脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.11%，紅花油中亞油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在79.89%，選擇水解率為8%﹑20%﹑80%的水解樣品進(jìn)行分析測(cè)試,容易判斷脂肪酶是否對(duì)脂肪酸種類具有選擇性.以3種酶水解紅花油，水解條件為35 ℃,200 r/min，m(油)∶m(水)=1.以3種典型水解率(即8%、20%、80%)的產(chǎn)物為樣品,將水解產(chǎn)物中的游離脂肪酸與混合酯分離后，分別測(cè)定酸值(AV)和碘值(IV). 水解條件及水解率見表4，游離脂肪酸及混合酯的酸值及碘值測(cè)定結(jié)果見表5.

表5 脂肪酸種類選擇性測(cè)定結(jié)果

從測(cè)試結(jié)果可以看出，分離出的酸和酯的純度較高(97%以上)，說(shuō)明游離脂肪酸與混合酯的分離程度較高；在幾種典型水解率下，酸與酯類的碘值差別很小，且都接近紅花油的碘值，說(shuō)明這幾種酶在水解油脂時(shí)對(duì)飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸的水解能力相同，不具有脂肪酸選擇性.

3 結(jié) 論

本文對(duì)脂肪酶脂肪酶Lipase LVK、Lipase AY 30G、Lipase F-AP15的位置選擇性和脂肪酸選擇性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：脂肪酶Lipase LVK﹑Lipase AY 30G沒(méi)有位置選擇性和脂肪酸選擇性，而 Lipase F-AP15無(wú)脂肪酸選擇性，但有一定的位置選擇性.

參考文獻(xiàn)

[1] 辛嘉英，趙永杰，石彥國(guó)，等.水飽和離子液體中脂肪酶催化萘普生甲酯對(duì)映選擇性水解[J].催化學(xué)報(bào)，2005，26(2)：118-122.

[2] 杜 偉，李 瓊.有機(jī)相脂肪酶催化酮基布洛芬的立體選擇性酯化[J].微生物學(xué)通報(bào)，2000，27(6)：429-432.

[3] V.Tatum , C.K. Chow.Lipase catalyzed alcoholysis with superecritieal carbon dioxide extraction influenee of flow rate[J].Food Sci Technol,1992,(53):337.

[4] GB/T 5532-1995.Vegetable Oils-Determination of Iodine Value(植物油碘價(jià)測(cè)定)[S],1995.

[5] 黃健花，劉亞軒，宋志華，等.無(wú)溶劑體系脂肪酶催化大豆油水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)—界面面積與反應(yīng)初速度[J].中國(guó)油脂，2009,(12):39-43.

[6] 王 英，周劍忠，黃開紅，等.固定化脂肪酶催化大豆油合成生物柴油生產(chǎn)的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007,(5)：211-214.

[7] 張 敏，揚(yáng)金明，宋 潔，等.脂肪酶在催化合成脂肪族聚酯中的應(yīng)用[J].塑料,2009,(2)：62-64.