緱敬軒, 董文賓, 曾 橋

(1.浙江溫州輕工研究院， 浙江 溫州 325003；2.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引 言

幾丁質(zhì)(Chitin)又稱甲殼素、甲殼質(zhì), 是以β-1,4-N-乙酰-D-氨基葡萄糖為基本單位的直鏈多聚物.幾丁質(zhì)廣泛存在于甲殼綱動物蝦、蟹的甲殼，昆蟲的甲殼，真菌(酵母, 霉菌)的細(xì)胞壁中，是地球上蘊藏最豐富的有機物之一，在蝦蟹殼中的含量高達(dá)15%～30%[1].

幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物幾丁寡糖、殼聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖具有抗癌、抗菌、調(diào)節(jié)免疫和植物生長等作用，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值[2].目前這些產(chǎn)品主要用化學(xué)降解的方法來制取，造成比較嚴(yán)重的環(huán)境污染.酶降解法具有條件溫和、得率高且不污染環(huán)境等優(yōu)點[3]，目前所篩選的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株產(chǎn)酶量低，且酶活不穩(wěn)定，這是微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶應(yīng)用中所面臨的主要問題.篩選產(chǎn)酶量高的菌株，尋找合適的發(fā)酵工藝，是微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶研究的當(dāng)務(wù)之急.由于沿海地區(qū)每年生產(chǎn)大量的蝦蟹，因此目前篩選用的樣品主要采自沿海地帶[2,4,5]，而從內(nèi)陸淡水環(huán)境中采集樣品并篩選降解蝦蟹殼中幾丁質(zhì)的菌株則不多見.本研究從秦嶺山脈中有蝦蟹分布的河流采集土壤，從中篩選到產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的高產(chǎn)菌株并對其進行了初步鑒定.

1 材料和方法

1.1 材料

土壤樣品采自源于秦嶺的灃河、漢江等河道周圍.

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：蟹殼粉30.0，NH4NO35.0，土壤浸提液500 mL，自然pH.

分離和篩選培養(yǎng)基(g/L)：瓊脂粉14～20，KH2PO40.3，K2HPO40.7，F(xiàn)eSO4·2H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO40.001，膠體幾丁質(zhì)2，酵母膏2，pH7.0.

菌種保藏培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[6].

種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別是不含瓊脂的分離和篩選培養(yǎng)基.

1.3 膠體幾丁質(zhì)的配制

膠體幾丁質(zhì)的配制參考文獻(xiàn)[7]的方法并略作修改：稱20 g幾丁質(zhì)加入200 mL濃鹽酸，在40 ℃攪拌3 min，使之溶解.溶液中加入2 L 5 ℃的冷水，幾丁質(zhì)就作為膠體懸浮液沉淀下來.用粗濾紙過濾，過濾后的膠體沉淀用蒸餾水洗滌至中性.

1.4 DNS試劑的配制

參照宋宏新等的配方配制[8].

1.5 實驗方法

1.5.1 富集培養(yǎng)

稱取1 g土壤樣品放入100 mL的富集培養(yǎng)基中，于27 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d.

1.5.2 分離和初步篩選

將富集培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后，涂布于分離培養(yǎng)基上，27 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，挑出透明圈相對較大的菌株，經(jīng)多次劃線純化并鏡檢為純培養(yǎng)物后于4 ℃斜面保存.根據(jù)培養(yǎng)3 d后菌株透明圈和菌落直徑大小的比值，挑選出酶活力大的菌株進行復(fù)篩選.

1.5.3 復(fù)篩選

初篩選得到的菌株在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后以3%接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于27 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d.將發(fā)酵液離心后取上清液，通過DNS法測定酶活進行復(fù)篩選.

1.5.4 酶活測定方法

參照Antonio的方法[9]：取0.5 mL上清液與0.5 mL 1%膠體幾丁質(zhì)混合，于37 ℃恒溫30 min，放入沸水浴5 min，立即冷卻，并用DNS法[8]測定還原糖.相同方法制作N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.酶活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放相當(dāng)于1μmol NAG所需酶量為1個酶活力單位(U).

1.5.5 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)研究：菌株活化后接種分離培養(yǎng)基，于27 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色后于普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的細(xì)胞形態(tài).

16S rDNA序列分析：細(xì)菌總DNA的提取使用通用基因組小量抽提試劑盒SK1252(上海生工).PCR擴增采用16S rDNA通用引物[10]27f和1495r.反應(yīng)體系(50μL)為：Buffer 1× ; Mg2+2 mmol/L ; dNTP 各0.2 mmo l/L ;引物各1μmol/L;DNA聚合酶2U;模板20μg/mL .擴增程序：95 ℃、3 min 變性后于 95 ℃、1 min; 54 ℃、40 s; 72 ℃、1 min進行30 個循環(huán)，最后于72 ℃維持10 min .PCR產(chǎn)物由上海生工進行純化和測序.將所得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫并進行BLAST分析比對.

2 結(jié)果與分析

2.1 分離和初篩選

富集以后的菌懸液在分離培養(yǎng)基中形成的產(chǎn)透明圈的菌落占總菌落的比例顯著高于未經(jīng)富集培養(yǎng)的土壤菌懸液，證明富集培養(yǎng)可以有效地增加產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的數(shù)量，從而提高有效菌株的可能性.

表1 初篩選菌株的酶活力比較

R=透明圈直徑/菌落直徑.

根據(jù)篩選分離培養(yǎng)基上透明圈的有無及大小，共分離到200個產(chǎn)透明圈的菌株，經(jīng)多次劃線分離純化后接種斜面保存.這些菌株絕大多數(shù)為細(xì)菌，只有4個為放線菌.通過比較透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值R(見表1)，共選出R值較大的5個菌株進行進一步的篩選,其中D23透明圈最大(見圖1)，培養(yǎng)48 h其R值就達(dá)到9.

圖1 D23在篩選培養(yǎng)基中的生長情況(由于菌落周圍的幾丁質(zhì)被降解，形成透明區(qū)域，培養(yǎng)基局部含有幾丁質(zhì),因此為非透明區(qū)域)

2.2 復(fù)篩選

對初篩選得到的5株細(xì)菌進行發(fā)酵并用DNS法測定發(fā)酵液的酶活力.測定結(jié)果(見表1)同初篩選相比，各菌株的酶活力大小順序是一致的.菌株D23的酶活最大，達(dá)到了0.75 U/mL，超過了目前國際工業(yè)化幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌粘質(zhì)沙雷氏菌的原始出發(fā)菌株[5].

目前的文獻(xiàn)報道有若干菌株在最優(yōu)條件下得到的發(fā)酵液其酶活力比D23的酶活力略高[11,12]，但是考慮到以下兩個原因：第一,復(fù)篩選過程中，D23的發(fā)酵條件并未優(yōu)化，若采用最佳發(fā)酵條件，推測其發(fā)酵液的酶活會更高；第二,同已經(jīng)報道的菌株相比，D23的透明圈與菌落直徑比值明顯大一些，預(yù)計在進一步研究的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化產(chǎn)酶的發(fā)酵條件及酶反應(yīng)條件，酶的產(chǎn)量和酶活會有更大的提高，D23具有潛在的較高工業(yè)應(yīng)用價值.

圖2 菌株D23的形態(tài)學(xué)特征(1 000×)

圖3 菌株D23的16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株的形態(tài)觀察

菌株D23的菌落近似圓形，邊緣不整齊，扁平，表面有皺褶不光滑，在液體培養(yǎng)基中生長時形成菌膜.革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性桿菌，其大小為3.52×1.23 μm左右(見圖2).

2.3.2 16S rDNA序列分析

利用16S rDNA通用引物對D23進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3所示，表明擴增產(chǎn)物接近1 500 bp.對PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果得到D23 16S rDNA的序列片段為1 414 bp. 將所得序列輸入GenBank中用Megablast進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)相似性較高的16S rDNA序列均來自芽孢桿菌屬，其中同幾個已知的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)16S rDNA序列相似性達(dá)到99%以上.綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析，推斷該菌屬于芽孢桿菌屬的一個種(Bacillussp).

3 結(jié)束語

本研究采用透明圈法和DNS法測發(fā)酵液酶活相結(jié)合的辦法，從土壤樣品中篩選到一株產(chǎn)酶能力強，具有較高的潛在工業(yè)應(yīng)用價值的菌株D23.通過形態(tài)觀察以及16S rDNA序列分析，確定該菌株屬于芽孢桿菌屬.

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