董文賓， 許先猛

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 前 言

現(xiàn)代藥理研究表明[1]，杜仲含許多藥用有效成分，如生物堿、黃酮類、微量元素、維生素、氨基酸等，具有消炎抑菌、抗疲勞、降血壓、抗衰老、抗癌、增強免疫功能等諸多功效，而且杜仲作為保健食品原料已獲得國家批準.目前，杜仲及杜仲葉中的各功效已經(jīng)被國內(nèi)外學(xué)者廣泛研究，但是在其抗氧化、清除自由基方面的研究很少有報道.本研究測定了杜仲葉不同有機溶劑提取物對DPPH·的清除能力，對60%乙醇提取物進行了初步大孔樹脂分離純化，并且測定了初分離物對DPPH·的清除率，為杜仲葉在抗氧化、清除自由基的研究方面提供了一定的理論依據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：杜仲葉(采自陜西略陽)，陰干，粉碎過60目篩.

試劑：1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基，Sigma公司；95%乙醇，分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠；丙酮、乙酸乙酯，分析純，利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司；甲醇，分析純，天津市百世化工有限公司.

儀器：754PC型紫外可見分光光度計、722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；BS-224型電子天平，德國SARTORIUS公司；微量移液器，芬蘭Dragonmed 公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵，上海亞榮生化儀器廠；HYG搖瓶柜，上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司[2].

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

杜仲葉陰干→粉碎過篩→稱取→震蕩提取→過濾、離心→濃縮→干燥→測定

└→上柱→乙醇洗脫→濃縮→干燥→測定

1.2.2 操作要點

(1)原料選擇：杜仲葉粉碎，過60目篩.

(2)震蕩提?。赫鹗幪崛l件為30 ℃，50 r/min，提取12 h.

(3)離心：3 500 r/min，15 min.

(4)濃縮：濃縮過程中溫度不超過50 ℃.

(5)上柱：樹脂預(yù)處理[3]：選用樹脂XDA-8，取適量(30 g)用1 mol/L的NaOH溶液浸泡4 h，用純凈水洗至中性，然后用1 mol/L的HCl浸泡24 h，用純凈水沖洗至中性，用70%乙醇浸泡24 h備用.上樣：預(yù)處理后樹脂裝柱后用蒸餾水沖洗至無白色混濁、無醇味為止.將60%乙醇提取濃縮液緩緩加入柱中，恒速(10 mL/min)流出，至流出液與加入液顏色相同為止，多加1/2樹脂體積的樣液，靜置吸附24 h.

(6)洗脫：蒸餾水洗至基本無色→30%乙醇洗脫(500 mL)→60%乙醇洗脫(500 mL)→90%乙醇洗脫(500 mL).

(7)測定：操作迅速準確，盡量保證各待測管反應(yīng)同時進行，確保時間間隔在5 s內(nèi).

1.2.3 DPPH·清除率的測定[4]

在試管中加入4.0 mL 51.54 mg/mL DPPH 乙醇溶液和1.0 mL無水乙醇，混勻，反應(yīng)30 min后在517 nm處測吸光值，記為A0；加入4.0 mL 51.54 mg/mL DPPH 乙醇溶液和1.0 mL待測液，混勻，反應(yīng)30 min后測吸光值，記為A1；加入4.0 mL 無水乙醇和1.0 mL待測液，混勻，反應(yīng)30 min后測吸光值，記為A2.按照下列公式計算自由基清除率.

清除率=1-(A1-A2)/A0

2 結(jié)果與討論

2.1 杜仲葉不同溶劑提取物對DPPH·的清除作用

杜仲葉不同溶劑提取物對DPPH·的清除作用有所差別，為了評價不同溶劑提取物的抗氧化性能和自由基清除能力，本試驗選擇清除率為50%時不同溶劑提取物的質(zhì)量濃度(EC50)作為評價指標，EC50值越小，提取物清除自由基能力越強.杜仲葉不同溶劑提取物清除率與其質(zhì)量濃度之間的關(guān)系如圖1所示.

根據(jù)提取物清除率與抗氧化劑質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系，計算出杜仲葉不同溶劑提取物的EC50，結(jié)果如表1所示.

圖1 不同溶劑提取物的清除率曲線

表1 杜仲葉不同溶劑提取物的EC50

由表1可知：不同溶劑提取得到的杜仲葉提取物對DPPH·均有清除作用，其清除能力大小順序為95%乙醇提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>丙酮提取物.隨著樣品濃度增加，95%乙醇與甲醇提取物對DPPH·的清除率趨于平衡；乙酸乙酯與丙酮提取物對DPPH·的清除率可達98%.綜合考慮溶劑安全性及抗氧化能力，本試驗對杜仲葉乙醇提取物清除DPPH·的作用進行進一步研究.

2.2 杜仲葉不同濃度乙醇提取物對DPPH·的清除作用

研究表明[4,5]，用DPPH·法測定不同提取物的清除率，30 min左右反應(yīng)達到平衡.本試驗考察了0.33 mg/mL的30%、60%、95%乙醇提取物30 min內(nèi)時間與提取物對DPPH·清除率之間的關(guān)系，每隔2 min測定樣品并計算清除率，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同濃度乙醇提取物反應(yīng)時間與清除率的關(guān)系曲線 圖3 樹脂吸附后不同濃度乙醇洗脫物反應(yīng)時間與清除率的關(guān)系曲線

由圖2可知：不同濃度乙醇的杜仲葉提取物對DPPH·清除率大小順序為60%>95% >30%(乙醇提取物)，所以杜仲葉60%乙醇提取物抗氧化效果較好，本試驗繼續(xù)對杜仲葉60%乙醇提取物清除DPPH·的作用進行研究.

2.3 大孔樹脂分離純化組分對DPPH·的清除作用

用60%乙醇溶液提取杜仲葉，提取液經(jīng)濃縮后上柱、吸附，采用不同濃度乙醇進行洗脫，對洗脫液進行濃縮、干燥.配制0.33 mg/mL的30%、60%、90%乙醇洗脫物，測定各洗脫組分30 min內(nèi)時間與洗脫物對DPPH·清除率之間的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知：60%乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂吸附后，不同濃度乙醇洗脫組分對DPPH·都有一定的清除作用，其清除率大小順序為60% >90% >30%(乙醇洗脫物).

3 結(jié) 論

(1)4種不同溶劑杜仲葉提取物對DPPH·清除作用大小順序為：95%乙醇提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>丙酮提取物.提取物濃度與對DPPH·的清除率呈現(xiàn)非線性關(guān)系，隨著濃度的增加，各提取物對DPPH·的清除率增加速度不同.

(2)不同濃度乙醇的杜仲葉提取物對DPPH·的清除率大小順序為60% >95% >30%(乙醇提取物).

(3)60%乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂吸附后，不同濃度乙醇洗脫組分清除率大小順序為60% >90% >30%(乙醇洗脫物).

(4)經(jīng)大孔樹脂初步分離純化后的組分比粗提物組分對DPPH·的清除率大.

(5)杜仲葉提取抗氧化組分在加熱條件下和空氣中都有較好的穩(wěn)定性.

參考文獻

[1] 鄧素蘭,余繼宏,管 林,等.杜仲不同部位總黃酮含量的測定[J].生物質(zhì)化學(xué)工程,2007,41(3)：37-38.

[2] 李嬌娟,黃克瀛,龔建良,等.油茶葉乙醇提取物清除DPPH自由基作用的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2008,28(2)：81-86.

[3] 劉軍海,裘愛泳.大孔吸附樹脂提取純化杜仲葉綠原酸的研究[J].山東醫(yī)藥,2004,44(23)：1-3.

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[5] 李 紅,張元湖.應(yīng)用DPPH·法測定蘋果提取物的抗氧化能力[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,36(1)：35-38.