李萌萌 劉曉丹 曹夢瑤 張肖雅 劉華晶

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 黑龍江省 哈爾濱市 150030

DNA分子標(biāo)記在食用菌研究中的應(yīng)用

李萌萌 劉曉丹 曹夢瑤 張肖雅 劉華晶

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 黑龍江省 哈爾濱市 150030

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的DNA分子標(biāo)記技術(shù)不斷涌現(xiàn)并應(yīng)用于在食用菌遺傳育種、菌種和菌株鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位和克隆等研究中。本文對(duì)DNA分子標(biāo)記RAPD、SCAR、ISSR等方法的原理、特點(diǎn)和其在食用菌遺傳多樣性鑒定方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了重點(diǎn)闡述。

分子標(biāo)記技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一類遺傳標(biāo)記技術(shù)。分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳變異的直接反映。至今已經(jīng)發(fā)展了20多種基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)。這些DNA標(biāo)記技術(shù)可綜合為4大類：一是以Southern雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，如RFLP；二是以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，如RAPD、ISSR等；三是酶切和PCR相結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，如AFLP、CAPS等；四是其他DNA分子標(biāo)記，如SNP。與其他幾種遺傳標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有很多優(yōu)越性，如大多數(shù)分子標(biāo)記是共顯性遺傳，對(duì)隱性的農(nóng)藝性狀的選擇十分便利；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記直接揭示來自DNA的變異。

1 RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性)標(biāo)記技術(shù)

RAPD技術(shù)是1990年由Williams和Welsh領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)研究小組幾乎同時(shí)獨(dú)立發(fā)展起來的。它是建立在PCR基礎(chǔ)之上,使用一系列具有10個(gè)堿基的單鏈隨機(jī)引物，對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢測多態(tài)性。由于不同引物擴(kuò)增出的DNA片段不同，因此存在著大量的RAPD標(biāo)記。由于整個(gè)基因組內(nèi)存在眾多反向重復(fù)序列，因此需對(duì)每一隨機(jī)引物單獨(dú)進(jìn)行PCR，單一引物結(jié)合在反向重復(fù)序列上，在其之間的區(qū)域內(nèi),若遺傳特性發(fā)生變化,經(jīng)PCR擴(kuò)增后， 則導(dǎo)致一系列PCR產(chǎn)物表現(xiàn)差異性，由于使用一系列引物，幾乎整個(gè)基因組差異都會(huì)顯露出來，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后，通過EB染色或放射自顯影就可檢測出被擴(kuò)增的DNA多態(tài)性。

目前對(duì)多種食用菌的生活史和遺傳背景還不十分清楚，這給食用菌遺傳研究工作帶來很大困難。以往菌株的親緣關(guān)系和食用菌遺傳資源受環(huán)境因素影響，往往難以對(duì)形態(tài)差異較小的種間和種內(nèi)菌株加以鑒別，給雜交親本的選擇帶來很大困難。利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)選擇親本可克服傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，利用分子標(biāo)記所揭示的多態(tài)性通過各種數(shù)量分析方法計(jì)算相似系數(shù)，進(jìn)行聚類和排序分析，確立供試菌株的親緣關(guān)系或進(jìn)行種內(nèi)遺傳多樣性研究[1]。種質(zhì)鑒定和雜交種的鑒別是育種研究工作中的一個(gè)關(guān)鍵問題。運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)融合子和親本進(jìn)行聚類分析和相似系數(shù)分析,可以判斷原生質(zhì)體融合是否成功,染色體是否發(fā)生交換。

2 ISSR (簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增)標(biāo)記技術(shù)

ISSR是一種新型的分子標(biāo)記，是1994年由zietkiewicz等創(chuàng)建的一種簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記。ISSR標(biāo)記利用植物基因組中廣泛存在的簡單重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，引物由1～4bp組成的串聯(lián)重復(fù)序列和幾個(gè)非重復(fù)序列的錨定堿基組成，使引物與基因組DNA中SSR的5’或3’末端結(jié)合，對(duì)反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ISSR標(biāo)記具有如下特點(diǎn):(1)直接利用SSR對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,適用于任何物種。(2)符合孟德爾遺傳規(guī)律,多為顯性標(biāo)記。(3)穩(wěn)定性和可重復(fù)性高。(4)引物具有通用性。ISSR標(biāo)記結(jié)合了RAPD和SSR方法的優(yōu)點(diǎn)，具有模板用量少、多態(tài)性豐富、無需試劑盒等優(yōu)點(diǎn),但多為顯性標(biāo)記,不適于研究交配系統(tǒng)、計(jì)算雜合度和父系分析等問題。ISSR標(biāo)記可廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物種質(zhì)鑒定、遺傳作圖和基因定位,尤其在分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)貧乏的作物研究中顯示出極大的優(yōu)勢。梁宇采用ISSR標(biāo)記對(duì)外生菌根菌隱花青鵝膏菌的居群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,分析結(jié)果表明,遺傳變異主要表現(xiàn)在同年生子實(shí)體內(nèi),隔年生子實(shí)體的變異情況也較明顯。此外，在其他如菊科作物中ISSR技術(shù)也被應(yīng)用在種質(zhì)資源鑒定[2]。

3 SCAR (特征性片段擴(kuò)增區(qū)域)標(biāo)記技術(shù)

1993年,PARAN I和MICHELMORE RW在RAPD標(biāo)記基礎(chǔ)上提出了SCAR標(biāo)記。該標(biāo)記以特異RAPD片段序列為基礎(chǔ),根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)1對(duì)18～24個(gè)堿基的引物，在較高的退火溫度下進(jìn)行特異性擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)由RAPD標(biāo)記到SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化。它直接采用專一性特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,排除了隨機(jī)引物結(jié)合位點(diǎn)之間的競爭，且避免了篩選引物、估算樣品間遺傳相似性和聚類分析等繁瑣過程,使穩(wěn)定性和重復(fù)性得以顯著提高。SCAR標(biāo)記一般表現(xiàn)為擴(kuò)增片斷的有無,適合于大量個(gè)體的快速檢測,便捷可靠；目前SCAR標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于許多重要農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物的種質(zhì)鑒定、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和基因定位等方面研究。SCAR標(biāo)記需要根據(jù)目的片段的兩端序列設(shè)計(jì)引物,無法進(jìn)行直接分析,一般是對(duì)RAPD或AFLP標(biāo)記進(jìn)行克隆、測序后轉(zhuǎn)換為SCAR標(biāo)記。由于RAPD擴(kuò)增過程中堿基并非嚴(yán)格匹配,錯(cuò)配率較高，且一般RAPD標(biāo)記片段同源性較高,從而導(dǎo)致SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)換成功率較低。在食用菌研究中,如果能獲得各個(gè)菌株的特異SCAR標(biāo)記,不僅能對(duì)種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行系統(tǒng)地分析評(píng)估,可以從分子水平上進(jìn)行偽劣菌種辨別。熊芳等為有效解決鮑魚菇市場菌種名稱異?；靵y的現(xiàn)象,對(duì)全國16株常用鮑魚菇栽培菌株進(jìn)行SRAP-PCR、RAPD-PCR擴(kuò)增,從電泳圖譜上選取特異片段,成功轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記,通過構(gòu)建的4對(duì)SCAR特異性引物,將這16株鮑魚菇菌株分為5類,有效地解決了鮑魚菇市場上常見的同種異名、同名異種現(xiàn)象[3]。

4 結(jié)語

對(duì)于食用菌種質(zhì)群鑒定和多樣性評(píng)價(jià),RAPD是一個(gè)簡單、經(jīng)濟(jì)、快捷的技術(shù)工具。RAPD分析便于繪制簡單的數(shù)量性狀圖譜,已經(jīng)被用于分析這些基因,鑒定與性狀相連鎖的分子標(biāo)記； ISSR標(biāo)記與RAPD等標(biāo)記技術(shù)相比，具有更強(qiáng)的專一性、重復(fù)性和可操作性；SCAR標(biāo)記技術(shù)因其具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，成本低廉，操作簡單方便等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)作物的品種鑒定、輔助選擇育種、基因定位等方面，在食用菌菌株鑒定中也開始受到重視。

總之，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的深入，更多的食用菌功能基因?qū)⒈粯?biāo)記，更高密度、更為實(shí)用有效的遺傳連鎖圖譜將被建立，大量重要的基因?qū)⒈欢ㄎ?、分離和克隆，這將為進(jìn)一步培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、耐貯等新品種奠定良好的基礎(chǔ)。

[1]呂長武,呂杰,陳恒雷 等. RAPD分子標(biāo)記在食用菌研究中的應(yīng)用[J].中國生物工程雜志.2006, 26(1): 77~80

[2]曾麗,趙梁軍,孫佳 等.萬壽菊屬品種資源遺傳關(guān)系的ISSR分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué).2010,43(1):215-222

[3]熊芳, 鄭閩江, 劉新銳 等. 鮑魚菇種質(zhì)資源SCAR標(biāo)記的建立及其初步應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào).2010,26

(11):330-335

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院青年基金

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.02.029

李萌萌（19890206），女，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院應(yīng)用生物科學(xué)專業(yè)08級(jí)本科生；

劉華晶（19790212），女，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院講師。

ISSR；SCAR；RAPD；食用菌