宋祥福，孫冰雪，張靜春，龔守良

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)院藥物制劑，長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春 130033）

腹部接受一定劑量射線照射后，小腸因其黏膜上皮生長(zhǎng)代謝活躍，對(duì)電離輻射最為敏感，而成為受損傷的主要器官。放射性腸損傷疾病在治療中存在著很大的困難，目前多以對(duì)癥治療為主。MSCs具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，免疫原性弱，易從骨髓中分離、純化及體外擴(kuò)增等特點(diǎn)，因此是異體組織修復(fù)的理想的種子細(xì)胞。創(chuàng)傷可以刺激MSCs遷移至受損器官或組織，并有助于受損組織修復(fù)和重建［1］。為此，本研究擬通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠MSCs后注入放射性空腸損傷模型大鼠，觀察其移植后對(duì)空腸組織修復(fù)情況，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛 血清（Hyclone公司）、胰蛋白酶（Gibco公司）和4，6-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（Sigma公司）。倒置顯微鏡（日本Olympus）、冰凍切片機(jī)（德國(guó)萊卡）、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 MSCs分離、純化與體外培養(yǎng)與標(biāo)記

選用5d大鼠乳鼠（8.0～10.0g），頸椎脫臼法處死，75％酒精浸泡5min，無(wú)菌條件下快速分離股骨和肱骨，剪除骨兩端，用5.0mL L-DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔內(nèi)骨髓于培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，加入L-DMEM培養(yǎng)液（含15％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）以1.0×105/mL接種于50mL培養(yǎng)瓶中，37℃5％CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)，3d后第一次半量換液，以后換液依具體情況而定，細(xì)胞接近90％融合時(shí)，按1.5×104/mL傳代。倒置顯微鏡逐日觀察，直至貼壁細(xì)胞融合鋪滿瓶底，重復(fù)以上操作，反復(fù)傳代擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)［2］的方法選取第三代MSCs于注入前1d進(jìn)行標(biāo)記的MSCs DAPI標(biāo)記，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型，應(yīng)用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液和脂肪樣細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)MSCs定向分化，鑒定其分化能力。

1.3 放射性腸損傷動(dòng)物模型制作

選用成年Wistar雌性大鼠40只，清潔級(jí)，合格證號(hào)SCXK（吉）2003-0007體重240～260g。動(dòng)物稱重后10％水合氯醛麻醉（3.5mL/kg），仰臥在特制的固定盒中，以貴陽(yáng)醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)的X.S.S.Z 250型深部X線機(jī)給予全腹部照射，大鼠腹部給予1cm的組織補(bǔ)償，從劍突到恥骨聯(lián)合，照射面積8.5cm×8.5cm，源皮距60cm，單次照射劑量5Gy，每隔72h照射1次，共5次。

1.4 動(dòng)物分組及處理

將輻射大鼠隨機(jī)分為MSCs治療組（12只）和模型組（12只）和DAP標(biāo)記組（4只），另設(shè)正常對(duì)照組（12只）。取4只模型大鼠，于第3次照后靜脈注射DAPI標(biāo)記的MSC，分別在照射后2和7d取空腸，共聚焦顯微鏡觀察富集情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2只。MSCs治療組大鼠分別于第3、4、5次照射后，當(dāng)日尾靜脈注射同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞1mL，濃度1×106細(xì)胞/mL。正常對(duì)照組和輻射組不做其他處理，于最后一次注射MSCs后7d和30d處死各組動(dòng)物，病理學(xué)觀察空腸組織結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)

培養(yǎng)1d后，大部分細(xì)胞呈圓形貼壁，2d可見(jiàn)有少數(shù)細(xì)胞開(kāi)始伸出突起，呈梭形和多形性，3d后，許多細(xì)胞呈梭形貼壁，部分細(xì)胞可見(jiàn)脂肪滴樣空泡，待換液后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，潛伏期約為6～24h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約為2～5d，接種后6～7d進(jìn)入平臺(tái)期。細(xì)胞到第3代時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)梭形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞邊界清楚，細(xì)胞排列有一定的方向性，呈放射狀、或旋渦樣排列。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面不表達(dá)CD34，成骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)后，堿性磷酸酶染色深染，脂肪誘導(dǎo)體系后，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂滴（圖1，見(jiàn)彩插3）。體外DAPI標(biāo)記的MSC胞核呈明亮藍(lán)色熒光。

2.2 MSCs在大鼠空腸組織內(nèi)的富集

激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)MSCs注入2d切片背景出現(xiàn)熒光；7d時(shí)切片小血管壁呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光（圖2，見(jiàn)彩插3）。

2.3 各組大鼠空腸組織學(xué)觀察

正常大鼠空腸黏膜結(jié)構(gòu)清楚，隱窩深遂，腺體豐富；模型組7d黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，隱窩幾乎完全破壞，治療組7d黏膜壞死組織較少，黏膜增厚；30d模型組小腸出現(xiàn)間質(zhì)纖維增多；30d治療組核分裂相增加，黏膜增厚，絨毛逐步再生，較模型組增加明顯。間質(zhì)纖維增多減少，隱窩結(jié)構(gòu)基本清楚（圖3）。

A：正常組；B：模型組7d；C：MSCs治療組7d；D：模型組30d；E：MSCs治療組30d圖3 普通光學(xué)顯微鏡下各組小鼠空腸組織學(xué)形態(tài)A：Normal group；B：Irradiation group，7d；C：MSCs group，7d；D：Irradiation group，30d；E：MSCs group，30dFig.3 Histological appearance of the jejunal tissue.HE staining

3 討論

腸黏膜受損后腸道干細(xì)胞可沿著隱窩絨毛軸分化為成熟細(xì)胞，取代受損脫落和凋亡的細(xì)胞，參與腸道損傷的修復(fù)［3］。據(jù)此推測(cè)，在腸道發(fā)生急慢性損傷時(shí)，調(diào)整小腸干細(xì)胞的再生或外源性輸入干細(xì)胞可能成為一種新型的治療方法，有望加速黏膜上皮修復(fù)和胃腸功能的恢復(fù)。

MSCs是一種成體多能干細(xì)胞，具有巨大增殖潛能，能向多種類型的細(xì)胞分化。王蓓等［4］用腸壁固有層和黏膜下層的結(jié)締組織成功誘導(dǎo)MSCs分化成為上皮細(xì)胞，并具有腸上皮細(xì)胞的表型。Jiang等［5］發(fā)現(xiàn)，在體外誘導(dǎo)條件下，小鼠MSCs能橫向分化成胃腸道上皮細(xì)胞。既然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可以在誘導(dǎo)因子的作用下向腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。那么，也有理由認(rèn)為，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后，也可以在適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)誘導(dǎo)環(huán)境中，根據(jù)生命體的需要向其急需的有再生需求的腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并增殖分化替代損傷或壞死的細(xì)胞，使得受損組織得以恢復(fù)。骨髓來(lái)源的MSC能夠在移植后準(zhǔn)確定位于損傷部位，促進(jìn)損傷部位的愈合［6］。研究者將同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在腸缺血-再灌注損傷的動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在受體腸道內(nèi)定植，并可加速腸道損傷的恢復(fù)［7］。曹曉滄等［8］將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)小鼠輻射性腸道損傷模型體內(nèi)5周后，發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞分布于腸黏膜淋巴組織內(nèi)和腺上皮細(xì)胞間，小鼠的一般狀況和腸道病理學(xué)表現(xiàn)明顯改善。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致，把DAPI標(biāo)記的MSCs移植入放射性空腸損傷的大鼠體內(nèi)2d后，切片可見(jiàn)藍(lán)色熒光，7d時(shí)小血管壁呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光，說(shuō)明移植的MSCs通過(guò)血液循環(huán)遷移至受損的腸組織并參與再生修復(fù)，并且病理可見(jiàn)MSCs輸入后7d黏膜壞死組織較少，黏膜增厚，30d核分裂相增加，間質(zhì)纖維增多減少，隱窩結(jié)構(gòu)基本清楚，說(shuō)明MSCs被趨化到受損傷的空腸組織，參與了腸道黏膜的修復(fù)過(guò)程。

有研究表明：移植的MSCs通過(guò)血液循環(huán)遷移至受損組織，能夠減輕炎癥對(duì)腸組織的損傷［9］，并且在損傷的局部MSCs能夠促進(jìn)新生血管的生成，從而促進(jìn)組織細(xì)胞的增殖［10］。也有研究者認(rèn)為MSCs細(xì)胞也通過(guò)自分化、旁分泌和啟動(dòng)內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制參與再生修復(fù)［11］。關(guān)于MSCs的對(duì)損傷組織的修復(fù)機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

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