劉宇婧，劉 越，黃耀江，龍春林，2，①

人類社會發(fā)展至今，已經(jīng)通過分類學(xué)方法鑒定和描述了170萬種生物，然而這個數(shù)字僅僅是分類學(xué)家預(yù)計的全球物種總數(shù)的15％，因此，對地球上眾多的物種進行分類和鑒定仍然是全人類的一項長期而艱巨的任務(wù)。由于物種的形態(tài)會受到生物性別和發(fā)育階段的影響，因此，對物種進行分類客觀上存在一定的困難；同時，傳統(tǒng)分類學(xué)方法無法鑒定出許多群體中普遍存在的隱種(即外觀相似但遺傳特征截然不同的物種)，可能會導(dǎo)致物種劃分有誤，需要對這些物種進行訂正；另外，物種的分類需要長期的經(jīng)驗和知識積累，往往要很多年才能培養(yǎng)出一位擅長某一類群分類的專家。鑒于以上因素并基于對時間和成本的綜合考慮，開發(fā)一種更靈活的物種標準化鑒定系統(tǒng)已成為當(dāng)前生物分類學(xué)研究領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急［1-3］。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是以染色體組為基礎(chǔ)，用1段標準DNA序列作為標記實現(xiàn)快速、準確和自動化的物種鑒定方法，類似于超市用條形碼掃描識別成千上萬種商品，該方法是近幾年來迅速發(fā)展起來的一項全新的物種鑒定技術(shù)，為解決傳統(tǒng)分類學(xué)面臨的難題提供了新方法。除物種鑒定功能外，DNA條形碼技術(shù)還有助于發(fā)現(xiàn)新種和隱種，也可應(yīng)用于其他學(xué)科(如民族植物學(xué))的研究。該技術(shù)在動物研究中已得到廣泛的應(yīng)用，采用的標準片段是線粒體COI基因中1段約650 bp的DNA片段，然而，COI基因在植物中的進化速率遠慢于在動物中的進化速率，因此COI基因只適用于低等植物中某些藻類的鑒定［4-5］。迄今為止，在陸生植物中還沒有找到通用性DNA條形碼［6］。盡管如此，對植物DNA條形碼的研究依然在迅速有效地進行。構(gòu)建DNA條形碼標準數(shù)據(jù)庫、利用該技術(shù)鑒別已知物種和發(fā)現(xiàn)新種及隱種、重建物種和高級階元的演化關(guān)系，是目前分子生物學(xué)和分類學(xué)發(fā)展的最新研究方向，對植物保護生物學(xué)和生物多樣性研究具有重大意義。

DNA條形碼具有諸多優(yōu)點：①以信息穩(wěn)定的DNA序列為檢測對象，每一物種具有各自特定的DNA序列信息，同種生物不同生長時期具有相同的DNA序列信息，即使經(jīng)過加工使其形態(tài)發(fā)生變化，但其DNA序列信息不會改變，而傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒別特征會因趨同性和變異導(dǎo)致鑒定錯誤；與傳統(tǒng)分類方法相比，DNA條形碼技術(shù)擴大了檢測樣本的范圍，即使樣本部分受損也不會影響鑒別結(jié)果。②能夠拋開形態(tài)相似的假象，從基因水平上對傳統(tǒng)分類方法難以區(qū)分的類群進行物種鑒定。③建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，不但可以一次性鑒定大量物種，而且可以提供各物種的明確信息；不僅能夠彌補傳統(tǒng)分類學(xué)對物種形態(tài)描述的不足，而且還可以加快對已知物種的識別速度；同時還便于發(fā)現(xiàn)新物種，對分類學(xué)科的快速深入發(fā)展有一定的推動作用。④在DNA條形碼技術(shù)的基礎(chǔ)上研制簡便和高效的條形碼掃描儀，可以加快物種鑒定和進化研究的步伐，有益于推進分類學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱的國家，尤其是發(fā)展中國家物種鑒定及進化研究的步伐［2，7］。

1 植物DNA條形碼技術(shù)的研究進展

1.1 DNA條形碼的發(fā)展軌跡

從2003年至2009年，陸續(xù)召開了多次有關(guān)DNA條形碼的國際會議。2003年，20多位分類學(xué)專家、分子生物學(xué)家和生物信息學(xué)家在冷泉港召開了2次研討會，會議題目分別為“Taxonomy and DNA”和“Taxonomy，DNA and the Barcode of Life”，以期利用某個特定基因?qū)崿F(xiàn)物種鑒定的目標。2004年，由Sloan基金會贊助，在華盛頓史密森尼研究院(Smithsonian Institution)成立了生命條形碼聯(lián)盟(CBOL，the Consortium for the Barcode of Life)，大部分國家的自然歷史博物館、標本館、相關(guān)研究機構(gòu)和私人機構(gòu)等都加入了該組織，致力于鑒定生物物種全球標準的研制。2005年，由CBOL和英國自然歷史博物館主辦、在倫敦召開了生命條形碼協(xié)會第一屆國際DNA條形碼會議，決定為1 000萬個物種建立DNA條形碼編碼庫，并將其設(shè)置在GenBank中，作為一個向公眾開放的DNA序列數(shù)據(jù)庫。2007年，在臺北召開的第二屆國際DNA條形碼會議對理想DNA條形碼的選擇展開了深入的討論，并給予了高度的重視。2009年，在墨西哥城召開的第三屆國際DNA條形碼會議上，與會代表對植物DNA條形碼達成共識，決定將葉綠體基因片段rbcL和matK作為植物DNA標準條形碼的核心碼，同時建議將葉綠體基因片段trnH-psbA和核基因片段ITS作為植物DNA條形碼的補充碼；并指出ITS2片段雖然在DNA條形碼方面具有較大的潛力，但要警惕操作過程中的真菌污染問題。此外，要繼續(xù)開展通用單拷貝核基因片段的篩選和測試，這對推進全球DNA條形碼計劃有重要作用［8-10］。可見，DNA條形碼技術(shù)正成為國際上生物分類學(xué)研究的一個重要方向和主要研究手段。

加拿大圭爾夫大學(xué)(University of Guelph)教授、加拿大皇家學(xué)會會員Hebert率先將條形碼技術(shù)引入生物界并提出了“DNA條形碼”的概念。Hebert等采用線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(COI)上的1段基因序列，先后對脊椎動物和無脊椎動物11個門共13 320個物種進行比較分析，發(fā)現(xiàn)除腔腸動物(Cnidaria)外，98％ 的物種種內(nèi)遺傳距離差異為0％～2％，種間遺傳距離差異平均值為11.3％，說明這段COI基因序列具有良好的分類鑒別能力，并據(jù)此提出可以建立以1段長度為650 bp的COI基因序列為基礎(chǔ)的DNA條形碼識別方法［11-12］。

近些年來，國內(nèi)外的許多學(xué)者都對植物中適合作為DNA條形碼的基因序列進行了積極的探索和研究［6，11-15］。線粒體COI基因在植物中的進化速率遠遠慢于動物，因此，線粒體基因不適合作為大多數(shù)植物的DNA條形碼；核基因組通常具有多拷貝的特性，種內(nèi)變異較大，引物通用性較差，并且擴增時對模板DNA的質(zhì)量要求較高，不適宜于存在DNA降解的材料；葉綠體基因組相對保守，但包含許多變異區(qū)域，而且還具有一些自身的優(yōu)勢，如單親遺傳避免了基因重組、植物個體中均有大量的葉綠體，即使模板DNA高度降解也容易擴增成功。所以，從葉綠體基因組中選擇植物DNA條形碼是可行的。

目前，研究者主要通過單一片段或多片段組合2種植物DNA條形碼對相關(guān)植物物種進行分類鑒定研究，并嘗試建立植物DNA條形碼標準。

1.2 單一片段植物DNA條形碼研究進展及其優(yōu)缺點分析

1.2.1 單一片段植物 DNA條形碼的研究進展Newmaster等［16-17］通過對部分植物葉綠體基因組全面詳細的分析總結(jié)出以下幾點：①UPA片段是適合于藻類的DNA條形碼，同時也可以作為陸地植物DNA條形碼的組合條形碼之一；②trnD-trnY片段的分辨率比trnH-psbA片段高，但trnD-trnY片段目前在基因數(shù)據(jù)庫中的記錄不多，因此，尚未引起研究者們足夠的重視；③rbcL序列的進化率較低，不能用于識別全部物種，但可以區(qū)分許多同屬植物。有研究者提議將UPA片段作為光合作用植物的DNA條形碼，已有研究表明UPA片段在海藻中存在一定的變異，但在陸地植物中變異率很低［6，18-19］。在對陸地植物進行大尺度取樣研究后，Kress和Erickson提出：雖然rbcL片段的變異率低但通用性較好，可以作為DNA條形碼的核心片段，對不能識別的物種可以采用高變異率的trnH-psbA片段進行進一步的細分［20］。但是，在一些特殊的植物類群中，如傘形科(Umbelliferae)的獨活屬(Heracleum L.)和禾本科(Poaceae)的甜茅屬(Glyceria R.Br.)中，trnH-psbA片段的變異率較低［21-22］，因而trnH-psbA片段的使用應(yīng)根據(jù)物種而定。Lahaye等［23］用8個葉綠體 DNA片段對蘭科(Orchidaceae)植物進行了研究，通過比較最終認為matK片段可以作為有花植物通用的DNA條形碼。Fazekas等［6］采用matK、trnH-psbA、rbcL、ITS1、UPA、rpoB、rpoC1、atpF-atpH和psbK-psbI等片段對32屬92種共251株植物進行了研究，結(jié)果表明：在所有片段中trnH-psbA片段的擴增成功率和物種識別率均最高。Newmaster等［24］指出：采用matK、trnH-psbA和rbcL片段可以對金合歡屬(Acacia Mill.)類群進行有效的分類鑒定。Song等［25］采用rbcL、trnH-psbA、ndhJ、rpoB、rpoC1、accD、ycf5和 nrITS等片段對蓼科(Polygonaceae)的38個類群進行分析，指出trnH-psbA片段最適合作為蓼科植物鑒定的DNA條形碼。

在Hebert提出“DNA條形碼”概念后不久，中國學(xué)者也開始關(guān)注DNA條形碼技術(shù)。陳士林領(lǐng)導(dǎo)的研究小組針對753屬4 800種植物6 600個樣品的研究結(jié)果顯示：ITS2序列具有良好的通用性，在種級水平上的分辨成功率可以達到92.7％，為此，該研究小組建議將ITS2序列作為植物DNA條形碼之一［26］。作者所在的課題組利用目前植物DNA條形碼研究中的熱點候選序列ITS2、trnH-psbA、rbcL、rpoC1和ycf5對蕓香科(Rutaceae)72屬192個類群的300個樣本進行了研究和比較，結(jié)果顯示：ITS2序列具有良好的擴增效率和測序成功率，在所考察的候選序列中具有最大的種間變異和較小的種內(nèi)變異，且種間變異明顯大于種內(nèi)變異，同時，ITS2序列的物種鑒定成功率最高，其各個評價指標均優(yōu)于其他候選序列［27］；此外，ITS2序列在黃芪屬(Astragalus L.)類群中也具有很好的通用性，擴增效率為100％，測序成功率為85.7％，而且種間變異遠大于種內(nèi)變異［28］。還有研究者對全世界樺木科(Betulaceae)赤楊屬(Alnus Mill.)所有類群(共26種)的131個單株進行了分析，研究結(jié)果顯示：rbcL、matK、trnH-psbA和ITS片段在種級水平上的分辨能力差異較大，分辨率分別為10.0％、31.2％、63.6％和79.6％［29］。

1.2.2 常用單一片段植物DNA條形碼的優(yōu)缺點隨研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)一些單一片段DNA條形碼存在一定的局限性，尤其是matK、trnH-psbA、rbcL和ITS等常用植物DNA條形碼的缺點在一定程度上制約了DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展。

與其他片段相比，matK片段的進化速率較快，但該片段的引物通用性較差，鑒定不同類群時往往需要設(shè)計不同的引物［2，30］。Lahaye等［23］采用matK片段的390F/1326R引物對1 667個蘭科植物進行擴增，擴增成功率達到100％；但Fazekas等［6］采用相同引物獲得的擴增成功率卻低于50％，因此，matK片段的引物通用性還有待更多的實驗檢驗。

trnH-psbA片段是葉綠體基因進化速率最快的片段之一［31］，但該片段具有較高的突變率和簡單的序列重復(fù)和重排，在進行序列分析時需要人工校正［2］，從而限制了該片段在系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用。盡管如此，也有研究者認為：雖然trnH-psbA片段具有一定的缺陷，但仍然可以作為潛在的DNA條形碼［20］。

在大部分植物中，rbcL片段都比較容易擴增和測序，因而該片段被許多學(xué)者作為研究對象并開展了相關(guān)研究［2，16，32-33］，但植物中rbcL片段的進化率遠遠低于動物，且其變異主要存在于種級以上水平，種級水平的變異很小，因此，有研究者提出可以將該片段作為組合DNA條形碼之一［20］。

ITS序列在陸地植物中的引物通用性較差［20］，但是可將該片段作為一個潛在的DNA條碼用于相關(guān)研究［26，34］，已有學(xué)者開始關(guān)注ITS2片段。ITS2是ITS序列中的1個片段，位于5.8S和26S rRNA之間； ITS2片段較短，易于擴增和測序，尤其對發(fā)生DNA降解的材料更為有利［26-27，35］；該片段在物種水平上變異較大，已被廣泛用于物種分類及系統(tǒng)進化研究。盡管ITS序列比ITS2片段更早受到學(xué)者們的關(guān)注，但是在某些植物類群中ITS序列的擴增效率比較低，不符合DNA條形碼通用性的要求［26，28，36］。

葉綠體trnL(UAA)內(nèi)含子全序列及其p6環(huán)種間變異太小，限制了其在系統(tǒng)進化研究中的應(yīng)用，不適合作為陸地植物種級水平鑒別的DNA條形碼。雖有這些不足，但該片段仍有許多優(yōu)勢，例如：高度保守、擴增體系穩(wěn)定、p6環(huán)在DNA高度降解的樣本中仍可以成功擴增，因此，該片段在植物DNA條形碼中的應(yīng)用需要進一步研究［37］。

此外，還有一些非重點研究的片段，例如：在非被子植物中，rpoB2片段具有較低的擴增率；rpoC1片段雖然具有較高的擴增率，但突變率較低。這些片段均不適合用于種級以上水平的植物物種鑒定研究［2，38］。

1.3 多片段組合植物DNA條形碼研究進展

大量的研究結(jié)果表明：單獨使用某一個片段對所有的植物物種進行準確鑒定是不太可能的，為此，研究者們又相繼提出了不同的植物DNA條形碼的多序列組合方案。Kress等早在2005年就提出了多序列組合觀點，他們預(yù)測將trnH-psbA和ITS序列組合用于被子植物種類鑒定將有廣泛的應(yīng)用前景，但并未做具體的實驗研究［34］。同年，Chase等提出條形碼分析的“交通燈法”：首先使用葉綠體條形碼進行初步分析，用綠燈表示能被準確鑒定的物種；用黃燈表示存在問題的物種，再由分析者根據(jù)實際情況判定是否需要進一步的精確鑒定；用紅燈表示識別非常不準確的物種［39］。Newmaster等［17］則提出將等級分類的方法應(yīng)用于植物物種鑒定的觀點：首先選擇1個核心片段作為第1級條形碼，然后再根據(jù)不同類群選擇不同片段作為第2級條形碼。Chase等也提出了使用條形碼組合的建議，并指出：在rpoC1和rpoB與matK的組合中，rpoC1和rpoB序列的引物通用性較好，擴增成功率也較高，雖然進化速率較慢，但也能區(qū)分出許多物種；matK序列變異較大，能夠提供更多的識別信息，但是matK序列的引物通用性還有待進一步研究；在rpoC1和matK與trnH-psbA的組合中，保守的rpoC1序列和長度一定的matK序列可以保證大部分物種的種間鑒定，再加上高變異率的trnH-psbA序列就可以識別出更多的物種［30］。2005年，Kress和Erickson［20］通過對 rbcL、rpoC1、rpoB2、trnH-psbA、matK和ITS1序列的兩兩組合分析，最終確定rbcL和trnH-psbA組合適用于對陸地植物的識別和鑒定；在這些葉綠體基因片段中，rpoB2、rpoC1、rbcL、matK屬于編碼區(qū)片段，trnH-psbA屬于非編碼區(qū)片段。Fazekas等［6］認為：DNA條形碼的識別能力與組合片段的數(shù)目有一定關(guān)系；在兩兩片段組合中，rbcL和trnH-psbA組合的擴增率和物種識別率最高。通過對7個候選序列進行單個分析、兩兩組合分析和三個組合分析后，CBOL植物工作組指出：三個組合與兩兩組合的鑒別力一樣，而且增加了鑒別工作量和投入成本，建議將rbcL和matK組合作為鑒別陸地植物的通用DNA條形碼［2］。任保青等［29］認為：在整個植物界，若想用1個基因或1個短的DNA片段來區(qū)別所有物種幾乎是不可能的，但是可以通過1個條形碼組合在基因組范圍內(nèi)實現(xiàn)階層條形碼，進而逐級縮小鑒定范圍，最終達到物種自動鑒定的目的；在陸地植物中比較可行的DNA條形碼組合是rbcL、matK、ITS與trnH -psbA的組合，分別適于科級、屬級、種級類群的鑒別。

多序列組合方案為植物DNA條形碼的研究指出了一個新的方向，但根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果篩選出的片段并不能完全滿足DNA條形碼的標準，仍需要大量的實驗去驗證它們的物種識別和鑒定能力。

1.4 植物DNA條形碼標準的篩選

迄今為止，已有大量的DNA片段被作為DNA條形碼用于物種鑒定，有的是單一片段方式，有的則是序列組合方式，但目前對于植物DNA條形碼的選擇還沒有一個明確的標準。根據(jù)當(dāng)前的發(fā)展狀況，Kress等［34］和Taberlet等［37］提出了理想的DNA條形碼標準：①種間應(yīng)有明顯的變異以鑒別所有物種，同時種內(nèi)變異應(yīng)足夠小；②DNA條形碼應(yīng)盡可能標準化，即采用同一DNA片段來鑒定物種；③DNA片段應(yīng)足夠短，長度約700 bp，便于單向測序，也有利于PCR擴增，尤其是對DNA易降解的材料更有利；④存在高度保守區(qū)域，便于設(shè)計通用引物，并且該DNA片段易擴增和測序；⑤目標DNA條形碼應(yīng)包括足夠的種系進化信息，以便對物種進行系統(tǒng)分類。

Erickson等［40］提出了可進行量化和優(yōu)化的陸生植物DNA條形碼標準：①PCR擴增成功率至少90％；②選擇1個在系統(tǒng)進化研究中已經(jīng)被研究多年的DNA片段作為條形碼；③DNA條形碼之間應(yīng)具有互補性且不相關(guān)聯(lián)，將準確鑒定的可能性最大化；④使用的DNA條形碼在分類學(xué)應(yīng)用中應(yīng)具有普遍意義；⑤具有可行的生物信息學(xué)分析方法。

事實上，完美的植物DNA條形碼并不存在，對于不同的使用目的，以上標準并非都適用。例如，對于分類學(xué)家而言，DNA條形碼具有足夠種系進化信息和高度變異非常重要；而對于法醫(yī)鑒定或者加工食品的鑒定，DNA條形碼的標準化更為重要［39］。

2 植物DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用范疇

2.1 物種鑒定以及新種和隱種的發(fā)現(xiàn)

除了可以進行物種鑒定外，利用DNA條形碼技術(shù)還可以發(fā)現(xiàn)許多新種和隱種。例如，Lahaye等［23］單獨使用matK片段對分布在中美洲的1 000多種蘭科植物進行分析，顯示單獨使用matK片段能夠揭示隱種并且證明了DNA條形碼的可行性；2010年，Newmaster等［41］通過DNA條形碼技術(shù)發(fā)現(xiàn)了感應(yīng)草屬(Biophytum DC.)中的3個隱種，并發(fā)現(xiàn)了草沙蠶屬(Tripogon Roem.et Schult.)的1個新種。協(xié)助傳統(tǒng)分類方法發(fā)現(xiàn)那些形態(tài)相似但存在遺傳分化的隱種是DNA條形碼技術(shù)對分類學(xué)研究的重要貢獻，可顯著提高實地生態(tài)學(xué)考察研究的準確性和效率。

2.2 用于解決一些生物學(xué)問題

Jurado-Rivera等［38］認為：DNA條形碼還可用于解決一些復(fù)雜的生物學(xué)問題，如寄生關(guān)系等。通過擴增草食性動物牛的trnL基因，發(fā)現(xiàn)Peltoschema與4種寄生植物關(guān)系密切。因此，利用DNA條形碼可以正確識別寄生植物并確定營養(yǎng)關(guān)系。

2.3 在民族植物學(xué)研究中的應(yīng)用

值得一提的是，DNA條形碼技術(shù)在民族植物學(xué)研究中也得到了一定的應(yīng)用。民族植物學(xué)以傳統(tǒng)社會管理和利用的植物為主要研究對象，在研究過程中常常通過借助民間分類學(xué)家(parataxonomist)的知識來獲得當(dāng)?shù)厝藢χ参镞M行分門別類的信息。這些民間分類學(xué)家的知識有些是傳承自長輩、有些則結(jié)合了自己的觀察和實踐，他們不必像分類學(xué)家那樣一般需要獲得植物的繁殖器官才能有效鑒定物種，而是基于他們長期積累的知識、通過植物某個生長階段的某個(些)器官(通常是營養(yǎng)器官)，就能準確說出植物的當(dāng)?shù)孛Q、生長習(xí)性、資源和分布狀況、用途和用法等。在開展民族植物學(xué)研究的過程中，由植物分類學(xué)家和民間分類學(xué)家分別獲得的植物種數(shù)往往存在一定的差異，或前者數(shù)量多于后者，或后者數(shù)量多于前者。到底哪一個物種數(shù)是準確的?在沒有足夠的時間等待植物開花和結(jié)果的情況下，采集植物葉片通過DNA條形碼技術(shù)進行分類鑒定，是一種理想的快速鑒別方法?；谶@樣的設(shè)想，加拿大圭爾夫大學(xué)的Newmaster博士及其合作者，將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于民族植物學(xué)的研究。印度南部西高止山脈的2個山地部落Irulas和Malasars把在當(dāng)?shù)乇环Q為“Sunai pul”的1種草沙蠶屬禾草用于祭祀和其他經(jīng)濟用途，這種植物對當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)居民十分重要，因而當(dāng)?shù)氐拿耖g分類學(xué)家(或信息提供者informant)能輕易識別這一物種。有趣的是，這是1個植物分類學(xué)上的隱種，植物分類學(xué)家難以通過形態(tài)特征來識別。Newmaster等采用DNA條形碼技術(shù)，不僅證實了民間分類學(xué)家鑒定該物種的正確性，而且發(fā)現(xiàn)Sunai pul是植物學(xué)上的1個新種，將其命名為Tripogon cope Newmaster。因此，他們認為DNA條形碼技術(shù)可以應(yīng)用于一些民間分類群(ethnotaxon)的鑒定和識別［42］。Newmaster等還將DNA條形碼與基因組學(xué)的相關(guān)技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于印度一些部落的民間分類群，包括民族藥用植物。在此基礎(chǔ)上，他們提出了“民族植物基因組學(xué)”(ethnobotany genomics)的概念，認為通過民族植物基因組學(xué)的研究，可以識別一些隱種，還能確定一些珍稀植物的分布及其生態(tài)學(xué)特性［41］。

清風(fēng)藤屬(Sabia Colebr.)中的小花清風(fēng)藤(Sabia parviflora Wall.ex Roxb.)是1種非常重要的民間藥用植物，被貴州和云南的布依族民眾廣泛用于治療黃疸型肝炎、止血和消炎，布依族民眾也使用同屬植物作為代用品，但是一些形態(tài)相似的混淆品已經(jīng)進入市場。龍春林領(lǐng)導(dǎo)的研究組用trnH-psbA、rbcL和matK片段對6種清風(fēng)藤屬植物和7種市場混淆品進行鑒定［43］，結(jié)果表明：這3個DNA片段的擴增成功率和物種識別率都很高，且小花清風(fēng)藤與同屬替代品之間的序列差異率較低(僅為0.00％～0.86％)，但與混淆品之間的序列差異率卻較高(達24.50％)，說明布依族民眾識別清風(fēng)藤屬植物的傳統(tǒng)知識是可靠的。研究結(jié)果還表明，DNA條形碼技術(shù)不僅可以有效鑒別市場上小花清風(fēng)藤的混淆品，而且對民族傳統(tǒng)醫(yī)藥文化的保護有重要作用。

2.4 構(gòu)建AIT系統(tǒng)

2009年，Newmaster等［44］提出開發(fā)和研制 AIT (automated identification technology)系統(tǒng)，即：將1片未知的植物葉片插入AIT機，通過無線網(wǎng)絡(luò)，就可以獲得該葉片所代表植物的名稱、分布、化學(xué)成分、食用價值等，既省時又經(jīng)濟，可代替昂貴又費時的傳統(tǒng)分類方法，同時也減少了通過形態(tài)特征識別物種的一些限制因素。預(yù)計AIT系統(tǒng)可能會給生物界帶來革命性的改變，也會對人類社會產(chǎn)生重要影響。

3 植物DNA條形碼技術(shù)的工作流程及分析方法

3.1 工作流程

植物DNA條形碼技術(shù)的工作流程主要包括采集樣品、提取DNA、選擇DNA條形碼、設(shè)計引物或者使用通用引物、擴增序列、編輯與人工校正序列、分析結(jié)果、將最終結(jié)果提交至相應(yīng)數(shù)據(jù)庫等八大步驟。其中，采樣是全部工作的基礎(chǔ)，需要制定標準化流程以便能進一步復(fù)核研究結(jié)果。序列分析是DNA條形碼研究中最重要的一步，經(jīng)過對序列進行比對和人工校正后，采用MEGA或PAUP法計算物種的種內(nèi)和種間K2P距離(kimura-2-parameter distance)，以確定遺傳距離的閾值，比較種、屬和科3個水平上的序列差異。然后，根據(jù)上述分析結(jié)果建立系統(tǒng)進化樹，最后依據(jù)DNA條形碼分析的聚類結(jié)果就能對未知樣本進行分類和鑒定，也可以發(fā)現(xiàn)隱種［38，45-50］。

3.2 分析方法

由于植物的種間雜交現(xiàn)象比較普遍，因此植物DNA條形碼的分析方法也處于不斷的摸索過程中，目前報道的分析方法主要包括以下幾種：

3.2.1 DNA條形碼校對機制 在分析過程中，可能會由于多種原因?qū)е聰U增的序列不正確，如采樣時存在污染、PCR污染、測序過程錯誤等，可以通過DNA條形碼序列分析發(fā)現(xiàn)這些錯誤，并重新進行PCR擴增、測序和人工校正以糾正錯誤序列，或找多位專家對憑證標本進行重新鑒定。DNA條形碼序列具有三大校對防錯機制，即序列校對防錯、系統(tǒng)樹分析防錯、barcoding gap檢驗防錯，以確保DNA條形碼序列和物種的正確對應(yīng)關(guān)系［14］。

3.2.2 DNA條形碼序列分析 向GenBank提交獲得的序列后，用Clustal X軟件對序列進行排序并用DNAMAN軟件對序列進行比對后，使用Bioedit軟件完成格式轉(zhuǎn)換，再用MEGA4.0軟件進行統(tǒng)計分析并構(gòu)建系統(tǒng)樹，最后，用bootstrap分析法檢驗(1 000次重復(fù))嚴格一致性樹中各分支的可信度［2，14］。

3.2.3 DNA條形碼序列的鑒定效率評價 一般采用4種方法評價DNA條形碼序列的物種鑒定能力。

一是BLAST搜索法(相似性搜索算法)。該方法首先需要通過實驗建立物種的序列數(shù)據(jù)庫，并確定一個閾值，將樣本的DNA序列與全體序列進行比對，如果可以在數(shù)據(jù)庫中搜索到僅包含query序列及同物種的序列，則認為該query序列可以準確鑒定到種。該方法具有運行速度快、精確度高的特點。

二是序列之間遺傳距離的比較法。通過比較樣本DNA序列與全體序列的K2P距離，確定種內(nèi)和種間變異的閾值，即barcoding gap，進而評估其物種鑒定效果。常用柱形圖來呈現(xiàn)種內(nèi)及種間遺傳距離的分布頻度。該方法比較耗時，并且對于缺失位點和變異位點的等價處理會造成一些數(shù)據(jù)誤差［51］。

三是系統(tǒng)進化樹的建立。建樹的目的是為了檢驗每個物種的單系性，即同一物種的不同個體能否緊密聚集在一起，當(dāng)不同物種聚在一起時則認為該DNA條形碼不能夠正確鑒定物種［14，23，52］。

四是在篩選DNA條形碼的研究過程中，需要對各個片段的效果進行評估，因此需要對不同片段在種內(nèi)和種間的變異進行比較，目前采用Wilcoxon signed rank tests法進行比較。

4 影響植物DNA條形碼技術(shù)鑒定準確性的因素

4.1 物種的類型和數(shù)量

評價種內(nèi)距離通常采用3個參數(shù)，即K2P距離、平均θ值和平均溯祖度，這3個參數(shù)均會隨樣本數(shù)的增多而增大，因此應(yīng)盡可能增加物種內(nèi)的取樣個體數(shù)。然而，出于對成本的考慮，通常認為每個物種內(nèi)的個體采集數(shù)量應(yīng)盡量不超過10個，并且最好包括5個居群的個體，這就要求研究者必須對擬作為DNA條形碼使用的基因片段有充分的了解［53］。此外，還可以應(yīng)用種間距離平均值(average interspecific distance)、種間平均變異θ值(average theta prime)和種間最小距離(smallest interspecific distance)［26，51］這3個參數(shù)來對種間差異進行評估。

4.2 系統(tǒng)樹構(gòu)建方法

系統(tǒng)樹又叫進化樹，構(gòu)建進化樹的方法主要分為獨立元素法(discrete charactermethod)和距離依靠法(distancemethod)2種。其中，獨立元素法包括最大簡約性法(maximum parsimonymethod)和最大可能性法(maximum likelihood method)；距離依靠法包括除權(quán)配對法(UPGMA)和鄰位相連法(neighborjoining)。Lahaye等［23］對進化樹進行了分析，認為MP和UPGMA的物種正確識別率相對較高，但結(jié)果相差不大時選用NJ樹則能達到快速簡便的效果。不同建樹方法得到的結(jié)果有一定差異，只有采用適當(dāng)方法構(gòu)建的進化樹才會接近真實的“進化樹”。

4.3 雜交/基因滲入

通常，物種間的邊界會由于雜交或基因滲入等原因而顯得模糊不清，這種情況下需要通過DNA條形碼的不同組合方式來增加標記數(shù)，以達到準確區(qū)分物種的目的。

4.4 物種起源時間的差異

如果物種之間產(chǎn)生生殖隔離的時間非常短，那么采用DNA條形碼技術(shù)來鑒定這些物種就比較困難。然而，化石記錄顯示大多數(shù)物種分化時間都超過了100萬年，因此，對于大部分物種而言，采用DNA條形碼技術(shù)進行鑒定工作比較簡單［54-55］。

4.5 分子進化速率差異

有研究表明，如果某個類群中的各個譜系分子進化速率不一致且差異達到100倍時，由于進化快的譜系存在2次突變，在這個類群中鑒定出進化速率慢的物種將變得非常困難［56］。因此，分子進化速率差異對DNA條形碼技術(shù)鑒定物種的準確率有較大影響。

5 植物DNA條形碼技術(shù)研究存在的問題與展望

自Hebert提出“DNA條形碼”概念以來，該技術(shù)得到了許多生物學(xué)家的支持并有較大進展。由于COI基因在動物鑒定中幾乎百分之百的成功，因此許多學(xué)者認為DNA條形碼技術(shù)在一定條件下是可行的［11，57-58］；然而，也有部分學(xué)者持懷疑和反對態(tài)度，認為采用DNA條形碼技術(shù)將是一種倒退［59］，會將分類學(xué)退回到類型學(xué)［60］。雖然有人認為傳統(tǒng)分類學(xué)在未來將被DNA條形碼取而代之，但多數(shù)學(xué)者認為DNA條形碼可彌補傳統(tǒng)分類學(xué)方法的不足，是對日漸萎縮的傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)強有力的補充。此外，還有一些學(xué)者認為如此短的DNA片段不能提供物種水平的可靠信息，完全依靠DNA條形碼會導(dǎo)致鑒定錯誤。

同一DNA條形碼片段在不同類群中的應(yīng)用效果不一樣，因而目前尚未獲得一致的植物DNA條形碼標準片段，因此，當(dāng)前的研究熱點仍然是對可能的DNA條形碼片段進行選擇和評價，并進行更大規(guī)模的分析和整體評價。將DNA條形碼技術(shù)與其他分類學(xué)方法結(jié)合使用，有助于區(qū)別個體及加快發(fā)現(xiàn)新物種的速度，然而，DNA條形碼只能作為一種初步篩選技術(shù)達到快速識別的目的，若要最終確定一個新物種，還需要經(jīng)過很多縝密的檢測手段。目前，植物DNA條形碼的分析方法還不夠成熟，需要生物信息學(xué)領(lǐng)域的專家開發(fā)出適合多片段和針對某些特殊片段的分析方法。另外，對于植物DNA條形碼技術(shù)的價值還存在一些爭議，關(guān)于該技術(shù)能否適用于動植物近緣和近期分化物種的鑒定也存在較大的爭議，這也是DNA條形碼技術(shù)研究的難點［41，61-65］。

雖然目前在DNA條形碼研究中投入的資金比較大，但是一旦成功構(gòu)建出一個標準、統(tǒng)一的DNA條形碼序列數(shù)據(jù)庫，設(shè)計出AIT系統(tǒng)，不僅能方便不同人群和民眾準確地采集和鑒別植物，而且還能滿足不同背景的專業(yè)人員快速鑒定植物的需求，并能降低鑒定物種所需的人力和資金成本。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，測序過程將會更快速、更便宜，從這個意義上講，DNA條形碼技術(shù)是一個快捷、經(jīng)濟又實用的技術(shù)［24］。

序列標記、DNA庫和組織庫(分類憑證標本)是實現(xiàn)條形碼標準化的3個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著條形碼序列數(shù)據(jù)的不斷積累及研究范圍的不斷擴大，同時伴隨大規(guī)模測序所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，條形碼研究會逐漸實現(xiàn)與世界范圍內(nèi)其他分類學(xué)研究計劃的協(xié)調(diào)發(fā)展，作為一種物種鑒定工具必將廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)分類學(xué)的研究，并在其他領(lǐng)域(如生藥學(xué)、民族植物學(xué)等)得到應(yīng)用。同時，包括質(zhì)體、核糖體、較短的低拷貝核基因等多個基因位點在內(nèi)的組合DNA條形碼的出現(xiàn)，將有效克服在被子植物物種分類和鑒定過程中經(jīng)常出現(xiàn)的由于雜交和多倍體現(xiàn)象所帶來的問題。

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