鄭元元 蔣軍廣 趙 娜 劉瑞芬 楊 超 張婧雯 孫 曼 張曉燕

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室，河南鄭州 450052)

肺癌是威脅人類生命的重大疾病，其發(fā)病率和病死率逐年上升。由人γ突觸核蛋白(γ-synuclein)基因(SNCG)編碼的γ-synuclein為天然無折疊蛋白，是乳腺癌的分子標記物，近來研究發(fā)現(xiàn)它在卵巢癌、消化系腫瘤中異常高表達，在晚期腫瘤中表達尤其顯著。γ-synuclein的過表達能夠增加癌細胞的侵襲轉移能力以及對某些化療藥物的耐受性，也使其成為潛在的治療靶點。但國內外文獻對于 γ-synuclein在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及其臨床意義報道不多。本實驗應用免疫組織化學的方法檢測γ-synuclein在NSCLC中的表達，試圖探討NSCLC的發(fā)生、進展和侵襲機制，期望對NSCLC的診斷、治療及預后評估提供實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 隨機選取60例2006年1月至2008年12月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科手術摘除的NSCLC病人的標本作為觀察組，其中男44例，女16例，年齡36～75〔平均(57.92±17.04)〕歲。所有病人在手術前均未行任何抗腫瘤治療。鱗癌34例，腺癌26例;高分化20例，中分化26例，低分化14例。按照美國聯(lián)合癌癥分類委員會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(FIGO)2002年制定的分期標準:Ⅰ期16例，Ⅱ期12例，Ⅲ期21例，Ⅳ期11例。對照組為20例癌旁正常肺組織(距癌組織均＞3 cm)。所有標本均為甲醛固定、石蠟包埋組織。兔抗人γ-synuclein多克隆抗體濃縮型(Bioworld Technogy Inc)，生物素-鏈霉菌素-過氧化物酶(S-P)法通用試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自北京博奧森生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 采用S-P免疫組化法，嚴格按照S-P試劑盒說明進行，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。步驟:石蠟切片脫蠟水化，于枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.1)中行微波抗原修復，過氧化物酶阻斷劑阻斷內源性過氧化物酶活性，非免疫性動物血清阻斷非特異性反應，滴加兔抗人γ-synuclein多克隆抗體，4℃過夜，加生物素標記的第二抗體，加鏈霉抗生物素-過氧化物酶溶液，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

1.2.2 結果判定 以免疫組化染色后細胞質或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性判斷標準。根據(jù)染色的程度分為3級:無著色(1級)評1分，淺黃色(2級)評2分，棕黃色(3級)評3分;高倍鏡(400倍)下每個視野計數(shù)100個細胞，每張切片數(shù)5個視野。按照鏡下陽性細胞數(shù)占癌細胞總數(shù)的百分比來綜合判斷，陽性細胞數(shù)≤25%評為1級(分)，26% ～75%評為2級(分)，≥76%評為3級(分)。最后每張切片的兩次評分的乘積為其最終得分(1～9分)，＞7分的為陽性表達(+)，＜7分的為陰性表達(－)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用χ2檢驗及四格表資料的精確概率法，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果

2.1 γ-synuclein在NSCLC組織中的表達 免疫組化結果顯示，γ-synuclein免疫組化陽性產物主要定位于細胞質，也可見定位于細胞核。60例NSCLC組織中γ-synuclein表達的陽性率為46.7%(28/60)，20例正常肺組織無1例陽性表達(0%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。

2.2 γ-synuclein表達與NSCLC臨床病理特征的關系 高中分化的NSCLC患者中γ-synuclein的陽性表達率為34.8%，低分化為85.7%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者中γ-synuclein的陽性表達率為28.6%，Ⅲ、Ⅳ期患者γ-synuclein的陽性表達率為62.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.009)。伴淋巴結轉移的NSCLC患者中γ-synuclein的陽性表達率為87.5%，不伴淋巴結轉移的患者為19.4%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。γ-synuclein的表達與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的大小、病理類型、臨床分型、有無胸腔積液及是否吸煙無關(均P＞0.05)。

3 討論

synucleins是小分子可溶性蛋白質家族，目前有α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein 3個成員，主要在神經元表達，在突觸前末梢尤為豐富。目前，對于他們的生物學功能還沒有充分地了解，已有的研究結果顯示他們與神經系統(tǒng)的發(fā)育及某些神經變性疾病有關。γ-synuclein是該家族的第三個成員，其表達組織特異性較高，廣泛表達于腦組織中，主要位于細胞質和神經元的軸突內，在乳腺、肝臟、腎臟、肺臟、胸腺、心臟、卵巢、睪丸、前列腺、結腸和胎盤等組織中表達量極低或不表達。近來的研究發(fā)現(xiàn)，其表達異常不僅與神經退行性病變有關〔1，2〕，與細胞惡變也有一定的相關性。Ji 等〔3〕首先發(fā)現(xiàn)γ-synuclein在乳腺癌組織中高表達，并且惡性程度越高，其表達越高。隨后發(fā)現(xiàn)其在胃癌、卵巢癌、肝癌、骨肉瘤、肺癌和前列腺癌等組織中也有異常高表達。

γ-synuclein有促進腫瘤細胞的生長分化，增加癌細胞活動，促進癌浸潤轉移的作用，其機制可能是:①增強基質金屬蛋白酶 (MMP)活性。②與微管相關蛋白 (MAPs)相互作用。③抑制腫瘤生長抑制因子 (OM)。張惠卿等〔4〕的研究結果顯示:在正常乳腺組織和良性乳腺病變中未見γ-synuclein表達，在乳腺癌中γ-synuclein陽性率為38.9%，并且γ-synuclein的表達與TNM分期及有無淋巴結轉移有關，在早期 (0/Ⅰ/Ⅱ期)乳腺癌中輕度表達 (10.9%)，在晚期 (Ⅲ/Ⅳ期)乳腺癌中高表達 (80.8%)。動物實驗淋巴結切片鏡檢顯示，種植γ-synuclein陽性的瘤細胞組，75%存在腫瘤細胞轉移，而陰性組只有24%。在遠處肺轉移中，γ-synuclein陽性組也遠高于陰性組。類似的研究結果在卵巢癌、胃癌、骨肉瘤、胰腺癌等中均有報道，但是Zhou等〔5〕的研究發(fā)現(xiàn)在食管癌中γ-synuclein卻是低表達的，被認為可能是食管癌的負性調節(jié)因子。Liu等〔6〕用免疫組化方法，在八種腫瘤 (肝癌、食管癌、前列腺癌、宮頸癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌)中檢測γ-synuclein，均呈階段性增高。發(fā)現(xiàn)這種同一種基因在不同細胞或不同腫瘤組織中的生物學和生物化學的功能不同并不意外，因為腫瘤的發(fā)展是一個有關多基因的復雜現(xiàn)象，是涉及多步驟的一系列基因事件結果。國內外對γ-synuclein在NSCLC中的報道很少，本實驗結果顯示:20例正常肺組織無1例陽性表達，60例NSCLC中γ-synuclein陽性表達率為46.7%;高中分化的NSCLC患者中的γ-synuclein的陽性表達率為34.8%，低分化為85.7%，差異有統(tǒng)計學意義 (P=0.001)，表明γ-synuclein的表達與NSCLC的分化程度密切相關，隨著腫瘤分化程度下降，陽性表達率升高，推測γ-synuclein的表達呈惡性生物學行為;TNM分期Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者中γ-synuclein的陽性表達率為28.6%，Ⅲ、Ⅳ期患者γ-synuclein的陽性表達率為62.5%，差異有統(tǒng)計學意義 (P=0.009)，提示γ-synuclein的表達隨TNM分期進展而升高;伴淋巴結轉移的NSCLC患者中 γ-synuclein的陽性表達率為87.5%，不伴淋巴結轉移的患者為19.4%，差異有統(tǒng)計學意義 (P=0.000)，提示γ-synuclein可能與NSCLC的預后有關，通過對 γ-synuclein的檢測可以評價 NSCLC的預后。γ-synuclein的表達與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的大小、病理類型，臨床分型、有無胸腔積液及是否吸煙無關。

綜上所述，γ-synuclein的表達與NSCLC的發(fā)生、分化程度、TNM分期及淋巴結轉移密切相關，但γ-synuclein能否成為NSCLC新的診斷標志及判斷其預后的有效指標，還有待進一步研究。隨著對γ-synuclein信號調控機制和功能研究的日漸深入，可能為NSCLC的基因治療提供新的靶點和治療措施。

1 Lavedan C，Leroy E，Dehejia A，et al.Identification，localization，and characterzation of the human γ-Synuclein gene〔J〕.Hum Genet，1998;103(1):106-12.

2 Lu A，Gupta A，Li C，et al.Molecular mechanisms for aberrant expression of the human breast cancer specific gene 1in breast cancer cells:control of transcription by DNA methylation and intronic sequences〔J〕.Oncogene，2001;20(17):5173-85.

3 Ji H，Liu YE，Jia T，et al.Identification of a breast cancer-specific gene，BCSGl，by direct differential cDNA sequencing〔J〕.Cancer Res，1997;57(4):759-64.

4 張惠卿，張宇新，張作鳳，等.γ-Synuclein在乳腺癌中的表達及意義〔J〕. 中國腫瘤臨床，2005;32(1):9-12.

5 Zhou CQ，Liu S，Xue LY，et al.Down-regulation of oc-Synuclein in human esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2003;9(9):1900-3.

6 Liu H，Liu W，Wu Y，et al.Loss of epigenetic control of synuclein-gamma gene as a molecular indicator of metastasis in a wide range of human cancers〔J〕.Cancer Res，2005;65(17):7635-43.