朱炎杰 高維娟 (承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

細(xì)胞凋亡，又稱細(xì)胞程序性死亡，是指細(xì)胞在一定的生理或病理性條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過(guò)程，是一種主動(dòng)的、程序性的、細(xì)胞固有的生物學(xué)過(guò)程，其特征是一系列細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，包括染色體濃縮、核碎裂、細(xì)胞皺縮、凋亡小體形成等〔1，2〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注致神經(jīng)細(xì)胞死亡主要由凋亡所致〔3，4〕，細(xì)胞色素C(Cyt-C)和天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)家族在細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用〔5〕。近年來(lái)對(duì)兩種酶與各種疾病以及兩種酶與凋亡的研究逐漸增加，本文將就此作出綜述，同時(shí)探討二者在細(xì)胞凋亡中的關(guān)系。

1 Cyt-C與細(xì)胞凋亡

1.1 Cyt-C概述 Cyt-C是一種水溶性蛋白，由核基因編碼，分子量為12～13 kD，位于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)，呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ～Ⅳ之間，Cyt-C是線粒體呼吸鏈(MRC)中傳遞電子的載體。對(duì)線粒體能量代謝起重要的調(diào)節(jié)作用〔6〕。

無(wú)活性前體分子在胞漿內(nèi)合成的前Cyt-C是一種核基因編碼的水溶性蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為12～13 kD。電子在轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中，伴隨著質(zhì)子從基質(zhì)被泵到線粒體膜間隙，從而建立線粒體跨膜電位(ΔΦm)。當(dāng)質(zhì)子從線粒體膜間隙反流回基質(zhì)中，使另一個(gè)蛋白復(fù)合分子FOF1-ATP酶(或復(fù)合物Ⅴ)產(chǎn)生ATP。所有這些過(guò)程必須有序地進(jìn)行。如果Cyt-C缺失或其功能障礙將會(huì)導(dǎo)致線粒體呼吸鏈出現(xiàn)功能異常，結(jié)果ATP缺乏，使細(xì)胞死亡。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中Cyt-C釋放進(jìn)入胞質(zhì)，與凋亡活化因子1(Apaf-1)結(jié)合，Apaf-1與線蟲(chóng)的Ced-4相似，它的氨基端由caspase循環(huán)結(jié)構(gòu)域組成，羧基端有12個(gè)WD-40重復(fù)區(qū)，中間320個(gè)氨基酸殘基則與Ced-4有22%的同源，48%的相似性。Cyt-C可與Apaf-1的羧基端結(jié)合，通過(guò)Apaf-1的氨基端再與procaspase-9的功能前區(qū)相互作用，形成相對(duì)分子質(zhì)量為 700 ×103～1 400 ×103的巨大復(fù)合物〔7～9〕，自發(fā)激活caspase-9。Cyt-C/Apaf-1/caspase-9復(fù)合物即謂凋亡體，凋亡體內(nèi)活化的caspase-9作為蛋白酶激活下游的caspase家族如caspase-3、easpase-7。其中caspase-3是主要的凋亡效應(yīng)蛋白，它可激活CAD及ACINUS，繼而引起細(xì)胞核濃縮及DNA裂解，使細(xì)胞發(fā)生凋亡〔10〕。研究表明，在凋亡初期，Cyt-C從線粒體內(nèi)膜釋放，啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡機(jī)制。

1.2 Cyt-C在線粒體中的釋放機(jī)制 目前Cyt-C釋放的機(jī)制主要有兩種〔11，12〕:一是線粒體外膜蛋白聚合形成膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔(PTP)復(fù)合體，導(dǎo)致外膜非特異性斷裂〔13〕;二是促凋亡基因Bax的誘導(dǎo)作用，引發(fā)了細(xì)胞的凋亡。但抗凋亡基因Bcl-2可以阻斷Cyt-C的釋放和caspase的活化;Bcl-2家族蛋白如Bcl-2、Bcl-xL和Bax具有成孔性質(zhì)，估計(jì)它們直接調(diào)節(jié)線粒體膜對(duì)Cyt-C的通透性〔14，15〕。Cyt-C的釋放是細(xì)胞死亡程序中關(guān)鍵的一步。一種類(lèi)似白細(xì)胞介素1B轉(zhuǎn)換酶的caspase的激活是Fas和腫瘤壞死因子僅受體信號(hào)途徑的早期過(guò)程。該酶的抑制阻止了Cyt-C從線粒體中釋放，也抑制了Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但至今還未證實(shí)caspase與線粒體膜的主要成分直接反應(yīng)。在很多細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，caspase抑制劑并不能導(dǎo)致Cyt-C的釋放。由此可見(jiàn)，線粒體向胞質(zhì)釋放一些凋亡相關(guān)因子，啟動(dòng)凋亡反應(yīng)，其中最重要的是Cyt-C。

1.3 Cyt-C在細(xì)胞凋亡中的作用 線粒體Cyt-C是凋亡發(fā)生的閥門(mén)，能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝決定細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞受刺激后發(fā)生凋亡還是壞死，很大程度上取決于細(xì)胞內(nèi)ATP水平。如Cyt-C釋放后，細(xì)胞內(nèi)ATP仍能維持適當(dāng)水平，則釋放到胞漿的Cyt-C可通過(guò)激活caspase來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡;如釋放后細(xì)胞內(nèi)ATP不能維持適當(dāng)?shù)乃?，則細(xì)胞發(fā)生壞死。Cyt-C在凋亡中的作用，最初是在以胞漿抽提體系對(duì)凋亡研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的，即核凋亡(DNA片段化)依賴于某種細(xì)胞器碎片存在，隨后證實(shí)這種細(xì)胞器碎片的成分是Cyt-C。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，線粒體釋放到胞漿的Cyt-C可通過(guò)與apaf-1結(jié)合，招募caspase-9聚集，激活 Procaspase;在 dATP存在時(shí)，caspase-9可直接活化caspase-3，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔16〕。

Cyt-C可通過(guò)對(duì)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)和放大作用調(diào)控細(xì)胞凋亡，此作用正在被逐漸闡明。凋亡信號(hào)傳導(dǎo)有三條基本途徑:第一條是由膜受體(如 FasL)介導(dǎo)，激活 caspase-8，再激活caspase-3，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除直接活化caspase-3外，在Ⅱ型細(xì)胞(如肝細(xì)胞)，caspase-8還能通過(guò)裂解胞漿蛋白p22 Bid;引起線粒體細(xì)胞色素C釋放，并激活caspase-9、再活化caspase3，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ⅰ型細(xì)胞沒(méi)有這條分支，Bcl-2對(duì)膜受體介導(dǎo)的Ⅰ型細(xì)胞凋亡無(wú)保護(hù)作用。有研究報(bào)道〔17，18〕，caspase-8直接活化caspase-3的能力與活化的caspase-8的量有關(guān)，Cyt-C能放大這種效應(yīng)，確保收到凋亡信號(hào)的細(xì)胞發(fā)生凋亡。在某些細(xì)胞類(lèi)型，由caspase-8直接活化的caspase-3在凋亡過(guò)程中可能不起主要作用。如在TNF-α誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，盡管caspase-8可以直接激活caspase-3，但這并不是caspase-3激活的主要方式，因?yàn)閏aspase-8抑制劑對(duì)細(xì)胞存活率和caspase-3活性沒(méi)有影響，而抑制Cyt-C釋放不僅可明顯降低 caspase-3活性，而且顯著提高細(xì)胞存活率，提示線粒體釋放Cyt-C途徑是caspase-3活化的主要方式。第二條是由線粒體膜功能紊亂或損傷介導(dǎo)，各種凋亡誘導(dǎo)劑超載作用于線粒體，引起線粒體Cyt-C釋放，激活 caspase-9、再活化 caspase-3、-7，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第三條途徑，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放，導(dǎo)致胞漿內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，激活caspase-12，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，Cyt-C釋放還可通過(guò)引起線粒體呼吸鏈電子傳遞障礙，使活性氧(RoS)產(chǎn)生增加，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔19〕。

2 caspase與細(xì)胞凋亡

2.1 caspase家族概述 caspase全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶〔20〕。caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的蛋白酶。它們的活性位點(diǎn)均包含半胱氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。caspase負(fù)責(zé)選擇性的切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡。caspase蛋白族的分類(lèi)從1992年人類(lèi)第1次純化caspase-l并測(cè)序其cDNA，迄今為止已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物至少有14種caspase蛋白酶家族成員。根據(jù)caspase之間大小亞單位序列的同源性以及功能，可分為3組:①細(xì)胞因子處理組:caspase-l、-4、-5、-11、-12、-13、-14;②凋亡起始組Caspase-2、-8、-9和-10;③凋亡效應(yīng)組caspase-3、-6和-7。caspase在細(xì)胞內(nèi)合成和分泌。酶原含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)NH2-端結(jié)構(gòu)域，一個(gè)大的亞單位(相對(duì)分子質(zhì)量約20×103)和一個(gè)小的亞單位(相對(duì)分子質(zhì)量約10×103)。

所有的成員都保守性地包含有與底物P1Asp作用的氨基酸殘基，如在ICE中，它們是催化中心的Cys285，與酶/抑制劑復(fù)合物的巰基半縮醛以氫鍵結(jié)合的His237，以及可以穩(wěn)定反應(yīng)中間物氧陰離子的 Gly238。另外，Arg179、Arg341、Gln383和 Ser347形成容納P1Asp的“口袋”，Ser339靠近Cys285的巰基，以氫鍵結(jié)合P1位的酰胺。與P2～P4作用的氨基酸殘基則變異比較大，這可能是各個(gè)成員識(shí)別不同底物的特異性之所在。在活性Cys周?chē)陌被嵝蛄幸埠鼙Ｊ?，一般都?Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，在 caspase-8、caspase-10中為 QACQG，在caspase-9中是QACGG，這三個(gè)成員都有一個(gè)氨基酸殘基的變異，但這種變異不影響蛋白酶的剪切活性和特異性。

2.2 caspase的活化 未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被稱為“原結(jié)構(gòu)域”(pro-domain)的序列。酶原活化時(shí)不但要將原結(jié)構(gòu)域切除，并且要將剩余部分剪切成一大一小兩個(gè)亞基，分別稱為P20和P10，活性酶就是由這兩種亞基以(P20/P10)2的形式組成的。這種活化反應(yīng)也是Asp特異的，剪切發(fā)生在酶原中保守序列的Asp與其后的氨基酸殘基之間，一般是先切下羧基端的小亞基，然后再?gòu)拇髞喕陌被饲腥ピY(jié)構(gòu)域。這種剪切可以是酶原及中間活性酶自我催化，也可以是其他ICE家族蛋白酶的作用，還有其他酶類(lèi)如顆粒酶B參與。

caspase蛋白酶在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著中心的作用〔21〕。Fas與配體結(jié)合而活化后，首先引起YVAD和zVAD敏感的ICE家族蛋白酶活化，然后再活化DEVD敏感的蛋白酶。其中caspase-8是這一凋亡過(guò)程中首先被活化的ICE家族蛋白酶。caspase-8活化后，一方面它可以剪切活化caspase-3、caspase-7、caspase-4、caspase-9 和 caspase-10，通過(guò)這些蛋白酶剪切底物使凋亡得以進(jìn)行;另一方面，它的活性可以被CrmA所抑制，籍此可作為細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控因素作用的環(huán)節(jié)。

caspase-8的活化可以是Fas與其配體結(jié)合引起的FADD蛋白與caspase-8結(jié)合的結(jié)果，也可能是顆粒酶B、ICE等作用的結(jié)果。所以其他能夠引起細(xì)胞凋亡的因素也可以通過(guò)激活顆粒酶B或ICE來(lái)激活凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。caspase-8活化后引起caspase-3和caspase-7活化，這兩種酶都可以剪切PARP，引起DNA的降解。另外caspase-3還可以活化caspase-6，后者可以降解層蛋白B。此外，U1核糖體蛋白的70 kD亞基(U1-70K)、DNA依賴的蛋白(DNA-PK)的催化亞基、微絲相關(guān)蛋白Gas-2、-actin、PKC、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ等也都可能作為caspase-3和caspase-6的作用底物。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡過(guò)程中caspase-3、-6、-7是與CED-3最相似的蛋白酶，它們完成了大部分剪切底物的作用，發(fā)揮了CED-3在美麗線蟲(chóng)中發(fā)揮的作用。

2.3 caspase在細(xì)胞凋亡中的作用 caspase在凋亡的執(zhí)行過(guò)程中以一種很有程序的方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解體。它們切斷凋亡細(xì)胞與周?chē)?xì)胞的聯(lián)系，關(guān)閉DNA的復(fù)制與修復(fù)，阻斷RNA的剪接，降解DNA，破壞核的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞向外發(fā)出信號(hào)以便被周?chē)募?xì)胞吞噬，最后將細(xì)胞解體并包裹形成凋亡小體。

目前與caspase有關(guān)的凋亡通路至少有3種〔22〕:Cyt-C通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。caspase凋亡的所有途徑最終都是激活caspase-3而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶〔23〕。但要使下游的caspase-3激活，除了它的自我激活和非caspase蛋白酶活化外，起始caspase的轉(zhuǎn)活化也是很重要的。caspase-3是凋亡啟動(dòng)蛋白，在caspases家族中起關(guān)鍵作用，caspase-9是caspase-3的上游調(diào)控蛋白，caspase-9的活化能激活caspase-3而使細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究證明〔24〕，Apaf-3就是caspase-9，在生物體內(nèi)的心臟，睪丸和卵巢具有高水平的mRNA表達(dá)，在dATP存在的條件下通過(guò)Apaf-1和Cyt-C可以直接激活caspase-9。caspase-9 是個(gè)多功能的分子，間接活化 caspase-2、-6、-8、-10，直接活化 caspase-3、-7。

3 Cyt-C與caspase在細(xì)胞凋亡中的相互關(guān)系

線粒體Cyt-C與caspase之間關(guān)系密切。正常情況下caspase以無(wú)活性酶原形式存在于活細(xì)胞中，當(dāng)收到凋亡誘導(dǎo)信號(hào)刺激時(shí)，通過(guò)對(duì)其內(nèi)部門(mén)冬氨酸殘基位點(diǎn)的蛋白水解而激活。一旦caspase激活，將引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)裂解特異性底物及激活內(nèi)源性核酸酶，使凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)典型的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。線粒體釋放到胞漿中的Cyt-C可通過(guò)與Apaf-1結(jié)合，活化caspase-9，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而活化的caspase可通過(guò)對(duì)胞漿底物的裂解促進(jìn)線粒體Cyt-C釋放，如 caspase-8能通過(guò)對(duì) Bcl-2家族促凋亡蛋白p22Bid的裂解，促進(jìn)線粒體 Cyt-C釋放，caspase-3、-6、-7不能裂解p22Bid，但可通過(guò)對(duì)其他胞漿底物的裂解，啟動(dòng)線粒體Cyt-C釋放。資料提示:caspase可對(duì)胞漿底物裂解啟動(dòng)Cyt-C釋放，在凋亡過(guò)程中具有放大caspase瀑布效應(yīng)及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用〔25，26〕。

4 結(jié)語(yǔ)

Cyt-C具有調(diào)控細(xì)胞能量代謝和凋亡的雙重功能。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝，Cyt-C可調(diào)控細(xì)胞死亡方式，通過(guò)對(duì)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)和放大作用及引起ROS產(chǎn)生增加，線粒體Cyt-C可直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。大量研究結(jié)果支持Cyt-C的釋放促進(jìn)細(xì)胞凋亡。caspase在細(xì)胞凋亡過(guò)程中也發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)Cyt-C的釋放早于caspase的活化，對(duì)Cyt-C和caspase的深入研究將進(jìn)一步揭示一些疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并可能提供疾病預(yù)防和治療的新思路。

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