魏 娟 孫保權(quán) 卜子俊

（1.江蘇省南京市六合區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，南京 211500；

2.江蘇省南京市六合區(qū)第二畜牧獸醫(yī)站，南京 211500）

豬瘟（CSF）是的一種高度接觸性傳染病，由豬瘟病毒引起，以高熱稽留、出血和高死亡率為主要特征。呈以多發(fā)性出血為特征的敗血癥病變。慢性經(jīng)過的病例，主要是纖維素性壞死性腸炎，常伴有副傷寒及巴氏桿菌病繼發(fā)感染。由于廣泛使用豬瘟疫苗，近幾年來豬瘟發(fā)病呈非典型性發(fā)病。

目前，由于諸多原因致使CSF是成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的疾病。雖然我國(guó)早就研制出很成熟的豬瘟兔化弱毒疫苗，但由于豬瘟的流行特征發(fā)生變化，發(fā)生免疫抑制和免疫失敗，感染豬瘟后也不出現(xiàn)明顯癥狀，但持續(xù)排毒，必須利用各種診斷技術(shù)對(duì)豬瘟的抗原變異性進(jìn)行檢測(cè)。

2 病原體

豬瘟為單股正鏈RNA病毒。在病毒分類上屬黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）。基因組長(zhǎng)12.3 KB，病毒子直徑40～50 nm，病毒囊膜有55和46KD兩種糖蛋白，核衣殼則為36KD蛋白質(zhì)構(gòu)成。豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒之間，基因組序列有高度同源性，抗原關(guān)系密切，存在交叉反應(yīng)。

3 診斷方法

3.1 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)

3.1.1 免疫熒光試驗(yàn)（FAT） 用熒光物質(zhì)標(biāo)記提純后的豬瘟病毒抗體IgG，再去著染豬病料（如病豬扁桃體、淋巴結(jié)、腎等）的冰凍切片或觸片，再在熒光顯微鏡下觀察組織細(xì)胞內(nèi)是否有亮綠色熒光。如果被觀察的組織細(xì)胞內(nèi)有亮綠色熒光，就說明被檢病料中有豬瘟病毒感染。否則，就是豬瘟陰性。

免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果直觀、可靠，是目前國(guó)內(nèi)外最常用的方法，它是Robertso于1965 年首次報(bào)道的。主要檢測(cè)病豬扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟、脾臟等組織中的豬瘟病毒，在豬瘟病毒感染早期檢出率較高，還能檢出無明顯癥狀的帶毒母豬，并且可在12 小時(shí)內(nèi)判斷結(jié)果，既快速又準(zhǔn)確，所以常用于病程初期診斷、檢疫及豬場(chǎng)進(jìn)行豬瘟凈化。

3.1.2 血清學(xué)檢測(cè)方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的豬瘟檢測(cè)方法?？刹捎瞄g接ELISA和夾心ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，主要用于檢測(cè)血清抗體和組織中病毒，其中，間接ELISA主要用于鑒別感染時(shí)會(huì)受免疫的干擾，而夾心ELISA則用于豬瘟病毒的初步定型，檢測(cè)豬脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、肺臟等組織中的病毒，能檢測(cè)出是否為豬瘟強(qiáng)毒感染，具有高度特異性和敏感性，而且它的試劑比較穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單且無放射性危害。

3.2 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

3.2.1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） 在豬瘟診斷中針對(duì)的對(duì)象是病毒的核酸，根據(jù)豬瘟病毒基因特定的序列，合成一對(duì)特異性引物，在引物的介導(dǎo)和反轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ)鏈cDNA，加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最后擴(kuò)增靶DNA，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外燈照射下（254 nm）可見到特異擴(kuò)增區(qū)帶。該方法適用于各種含毒病料的檢測(cè)，可用于臨床診斷，其操作簡(jiǎn)單，并且特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可快速檢測(cè)。

3.2.2 反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-nPCR) 使用2對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物擴(kuò)增完整的片段。對(duì)組織材料、細(xì)胞或肉湯培養(yǎng)物中含量低的豬瘟病毒進(jìn)行二次擴(kuò)增，該方法能將我國(guó)流行的不同基因亞群的豬瘟病毒強(qiáng)毒與疫苗弱毒完全區(qū)分開來，且不與其他豬源病毒和牛病毒性腹瀉病病毒發(fā)生非特異反應(yīng)?？梢暂^快對(duì)豬瘟做出準(zhǔn)確診斷，并可將強(qiáng)毒感染豬迅速?gòu)娜醵疽呙缑庖哓i群中篩選出來，減少了未感染免疫豬被誤殺的可能性。

3.3.3 多重PCR(multiplex PCR)[2]指應(yīng)用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增一個(gè)基因中的幾個(gè)不同DNA片段，或不同基因的幾個(gè)DNA片段。多重PCR中所設(shè)計(jì)的多對(duì)引物對(duì)必須有非常接近的退火溫度，如果2對(duì)引物間的Tm值相差懸殊，可引起擴(kuò)增產(chǎn)物量的差別，常出現(xiàn)其中一個(gè)引物對(duì)無明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，靶基因DNA的擴(kuò)增長(zhǎng)度也必須相類似，否則較短的靶基因DNA的擴(kuò)增效率明顯優(yōu)于擴(kuò)增片段較長(zhǎng)的DNA。因此，為了取得相同的擴(kuò)增效率，必須調(diào)節(jié)各引物對(duì)之間的Tm值和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度以及各引物對(duì)的量。該方法具有高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確的診斷疾病，適合大量臨床樣品中病原體的快速診斷。

3.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 日本學(xué)者Notomi 博士于2000 年建立了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification ， LAMP)[3]，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等溫條件(65 ℃左右) 保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。LAMP 是一種嶄新的DNA 擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，具有替代PCR 方法的可能性。

3.3 基因芯片檢測(cè)技術(shù)

基因芯片（又稱DNA芯片）是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項(xiàng)高新技術(shù)，其原型是20世紀(jì)80年代中期提出的?；蛐酒臏y(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列?；蛐酒夹g(shù)為豬瘟診斷技術(shù)提供了新的技術(shù)理念，目前已經(jīng)正進(jìn)行這方面的研究，其研究成果將對(duì)我國(guó)豬瘟的防控具有深遠(yuǎn)意義。

[1] 李艷，仇華吉，王秀榮，等.鑒別豬瘟強(qiáng)毒和弱毒的反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 39 (9): 1907-1914.

[2] 謝玉潔. PRRS、PCVD和CSF 病毒多重PCR方法的建立及其應(yīng)用研究[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2008